膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、腦腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的疾病之一，目前尚缺乏有效的治療方法，預(yù)后較差。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出，為進一步理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展乃至復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機制提供了一條全新的途徑。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞學(xué)說，腫瘤干細(xì)胞是在腫瘤組織中存在的、少數(shù)具有不定增殖潛能的一類細(xì)胞，它可驅(qū)使腫瘤的形成和生長，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，因此腫瘤干細(xì)胞可以說是腫瘤的種子和源泉，對其生物學(xué)特征及基因、信號傳導(dǎo)機制的研究，將有助于從源頭上殺傷腫瘤細(xì)胞、治愈腫瘤。

2、近年來研究表明：神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)可能是腦腫瘤干細(xì)胞的主要來源。本研究正是基于這一理念，根據(jù)國內(nèi)外的研究資料，采用神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)和改良的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，從高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)中分離培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞，并從染色體異常的角度出發(fā)，探求其基因組學(xué)的變異。最后在體外條件下觀察其生物學(xué)特性和分化特點。 第一部分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞體外的分離、培養(yǎng)和純化

3、 目的：探討GBM腫瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化的方法。 方法：應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和改良神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在11例GBM中，懸浮培養(yǎng)GBM的腫瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法，篩選分離具有連續(xù)克隆能力的單細(xì)胞。選擇Nestin對其進行標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀檢測原代培養(yǎng)的細(xì)胞中Nestin+細(xì)胞的比例，以及克隆擴增后Nestin+細(xì)胞的比例。 結(jié)果：本組11例GBM樣本，除1例在培養(yǎng)過程中發(fā)生細(xì)菌污染外，其余l(xiāng)O例在體外培養(yǎng)的條

4、件下，均獲得了具有連續(xù)克隆及增殖能力、具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞。在有限稀釋克隆分選的過程中，能更為特征性的觀察到這一過程。而且在原代培養(yǎng)過程中，具有克隆能力的細(xì)胞表達(dá)Nestin+的比例為6.23％～40.28％，克隆分選后Nestin+的細(xì)胞比例顯著增加，達(dá)到74.46-82.14％。 結(jié)論：GBM中存在著一類比例較少的、具有自我更新和增殖潛能并表達(dá)Nestin+、具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，在體外可將其分離、培養(yǎng)和純化。

5、 第二部分 目的：探討GBM來源的腫瘤干細(xì)胞的分化特征，并就其干細(xì)胞源性進行鑒定，為腦腫瘤干細(xì)胞的進一步研究打下基礎(chǔ)。 方法：采用克隆分選后具有連續(xù)克隆及增殖能力的腫瘤細(xì)胞為研究對象，通過免疫組化的方法檢測其干細(xì)胞的表面標(biāo)志Nestin、CD133的表達(dá)情況，通過掃描電鏡和透射電鏡觀察其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特點，確定其干細(xì)胞的特征；再通過核型分析的方法探討此種干細(xì)胞是否存在染色體的異常，確定其腫瘤性；最后，將通過鑒定的腫瘤干細(xì)胞

6、接種于不含生長因子的無血清培養(yǎng)基，觀察其在體外條件下的分化特點。 結(jié)果：本組10例樣本在免疫組化檢測中均同時表達(dá)CD133、Nestin陽性；在掃描電子顯微鏡下，可見腫瘤細(xì)胞球由眾多的球形細(xì)胞組成，細(xì)胞表面分布有短而細(xì)的絨毛，保持細(xì)胞間的接觸，中心部位細(xì)胞排列緊密，周邊部位排列疏松，部分細(xì)胞表面發(fā)出豐富的膠質(zhì)絲樣突起，腫瘤球邊緣有細(xì)胞爬出；透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤球內(nèi)的細(xì)胞呈明顯的不均一性，多數(shù)細(xì)胞體積較大、細(xì)胞器不發(fā)達(dá)；核型分