FANCF基因沉默對人乳腺癌細胞生物學特性的影響.pdf

1、前言: FA/BRCA通路是正常細胞參與DNA修復(fù)、細胞周期與凋亡調(diào)控、解毒功能調(diào)節(jié)、生命信號轉(zhuǎn)導等必需的。如果該通路受損會導致細胞染色體不穩(wěn)定以及對DNA損傷劑高度敏感。FA復(fù)合體的穩(wěn)定和FANCD2的泛素化激活是FA/BRCA通路的關(guān)鍵步驟，而FANCF在此過程中發(fā)揮著重要作用。FANCF蛋白低表達或功能缺失會干擾FA/BRCA通路的正常功能，進而參與腫瘤發(fā)生及耐藥性的形成。目前，已在多種實體腫瘤中證實：FANCF蛋白低表達

2、或功能缺失，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的形成相關(guān)。而關(guān)于FANCF是否參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及耐藥性的產(chǎn)生與調(diào)控尚未見報道。 本實驗研究FANCF基因沉默對乳腺癌MCF7細胞生物學特性的影響，并檢測相關(guān)指標的變化，探討FANCF基因是否參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的形成。 實驗方法: 本實驗分為三部分： 1、FANCF-shRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)相關(guān)文獻報道，使用Ambion公司的在線設(shè)計軟件，設(shè)計并合

3、成能夠編碼針對FANCF基因的小發(fā)夾RNA(FANCF-shRNA)的DNA模板，將其插入到p SliencerTM4.1-CMVneo表達質(zhì)粒中，形成pSliencerTM 4.1-CMV-FANCF-shRNA重組質(zhì)粒；將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E coli感受態(tài)細胞JM109中，通過氨芐青霉素抗藥性篩選出成功轉(zhuǎn)化的陽性克隆，并進行擴增；通過PCR及基因測序方法篩選出插入正確的FANCF-shRNA表達質(zhì)粒； 2、MCF-7-FAN

4、CF-RNAi 細胞模型的建立：堿裂解法提取質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7 細胞，RT-PCR 法檢測 FANCF基因mRNA表達水平，確認 FANCF 基因沉默； 3、相關(guān)指標檢測：分別采用MTT法、流式細胞儀PI單染法及FITC/PI雙染法檢測FANCF基因沉默前后細胞增殖、周期及凋亡等生物學特性的變化；RT-PCR法檢測FANCF基因沉默前后耐藥相關(guān)基因BCRP、P-gp、MRP、LRPmRNA表達水平的變化。離體水

5、平探討FANCF與乳腺癌生物學特性及耐藥性形成的相關(guān)性。 實驗結(jié)果: 1、成功構(gòu)建FANCF-shRNA表達質(zhì)粒：含有重組質(zhì)粒的陽性克隆菌液PCR擴增片段約為250 bp，并且其基因測序結(jié)果顯示插入片段堿基排列順序正確，沒有突變，說明FANCF-shRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建成功； 2、成功建立MCF-7-FANCF-RNAi細胞模型：與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染FANCF-shRNA質(zhì)粒后第2天、第3天、第5天和第7天，F(xiàn)A

6、NCF基因mRNA表達水平均明顯減低，表達抑制率分別為36.51％±6.84％、37.03％±6.61％、53.03％±9.33％和39.51％±10.13％，說明FANCF基因沉默，MCF-7-FANCF-RNAi細胞模型成功建立； 3、FANCF基因沉默對人乳腺癌MCF-7細胞生物學特性的影響：與陰性對照組相比，F(xiàn)ANCF基因沉默可抑制MCF-7細胞增殖(轉(zhuǎn)染后48 h和72 h的抑制率分別為12.65％±1.24％和29.

7、64％±0.87％)，促進細胞凋亡(轉(zhuǎn)染后48 h和72 h的凋亡率分別為28.95％±1.81％和49.00％±2.32％)，并使細胞周期阻滯于S期(轉(zhuǎn)染后48 h，S期細胞比率為33.38％±0.68％)； 4、FANCF基因沉默對人乳腺癌MCF-7細胞耐藥性的影響：與陰性對照組相比，F(xiàn)ANCF基因沉默后，BCRP mRNA表達水平明顯降低，轉(zhuǎn)染后第3天、第5天和第7天的表達抑制率分別為35.14％±8.71％、38.39％