MicroRNa-34c在人腦膠質瘤中的表達及其對膠質瘤細胞生物學特性的影響和機制研究.pdf

1、神經膠質瘤是始發(fā)于顱內的最常見惡性腫瘤，占所有惡性中樞神經系統(tǒng)腫瘤的78％，占顱內原發(fā)腫瘤的40％。當今世界膠質瘤的治療仍然是神經外科領域最棘手的問題之一，目前，針對膠質瘤尚無有效的篩查或早期診斷方法，確診時往往已為晚期，盡管近幾十年來以手術為主的治療手段有很大的進展，但是膠質瘤的生長速度快、邊界不清、術后容易復發(fā)等特點都使膠質瘤的治療效果難以令人滿意，其預后尚不樂觀，其中多形性膠質母細胞瘤的中位生存期僅為12-15個月，因此在手術切除

2、腫瘤的同時必須尋找新的治療方法輔助治療才能使膠質瘤的治療產生本質的進步。近年來，有關神經膠質瘤的診斷和治療的研究已深入到了分子水平，涉及到膠質瘤發(fā)生，發(fā)展，尤其是演變過程的基因有多種。因此尋找與膠質瘤發(fā)生相關的致病基因，從基因水平上進行針對性防治可能成為有效治療膠質瘤的根本途徑。
　　 miRNAs是一類長約22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNAs，通過與靶mRNA3'非編碼區(qū)完全或非完全互補的結合而導致靶mRNA的降解或翻譯過

3、程的抑制，進而調控基因的表達，miRNAs能參與一系列重要的生物學行為，例如細胞分化、細胞增殖與凋亡、應激反應等，同時有報道m(xù)iRNAs與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，在腫瘤的發(fā)生過程中起到調控的樞紐作用，因此已經有專家預測，把miRNA作為腫瘤生物治療的靶分子將比編碼分子作為靶分子更加有效。miRNA將成為腫瘤生物治療領域的一個新亮點，可能會給腫瘤的藥物設計和進行針對性治療提供一個新的平臺。
　　 已有文獻報道m(xù)iR-34參

4、與p53和Notch信號通路的調控，具有腫瘤抑制的特性。在哺乳動物中，miR-34家族包括3類:miR-34a具有自己的轉錄本，而miR-34b和miR-34c則共享一個轉錄本。有報道稱在胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和非小細胞肺癌中miR-34a低表達或檢測不到。亦有報道m(xù)iR-34a在肺癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤的細胞系中處于失活狀態(tài)。有人報道在惡性黑色素瘤、結腸直腸癌、口腔鱗狀細胞癌中，由于CGP島甲基化表現(xiàn)為miR-34

5、b/c的失活。并且，miR-34a的低表達和非小細胞肺癌的高復發(fā)率相關，表明miR-34a能夠作為對非小細胞肺癌判斷預后的新的靶標。到目前為止，所有已發(fā)表的數(shù)據表明在惡性腫瘤中miR-34的失活是常有的事。但miR-34c作為miR-34家族中的一員，在膠質瘤中的表達及對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起到的具體作用還未見報道。
　　 本實驗應用定量PCR方法對18例腦膠質瘤標本和5例腦組織標本分別進行miR-34c-3p和miR-34c-5p含

6、量的檢測，研究miR-34c-3p和miR-34c-5p在人類腦膠質瘤中的表達及臨床意義。并應用LipofectamineTM RNAiMAX對人腦膠質瘤細胞株U251和U87進行轉染，采用多種方法對轉染后的膠質瘤細胞株的轉染效率、細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、細胞周期、細胞凋亡等生物學特性進行檢測，而后應用數(shù)據庫檢索miR-34c-3p和miR-34c-5p可能的下游靶基因，找到感興趣的共同調控的靶基因Notch2，并采用westen

7、blot實驗方法及熒光素酶報告基因技術進行直接驗證，探索miRNA-34c是否對靶基因Notch2有直接調控關系，進一步闡明作用機理，期望為膠質瘤的基因治療找到有效可行的治療靶點并為臨床應用提供理論依據，為腫瘤的治療提供一個新思路。本實驗共分三個部分。
　　 第一部分miRNA-34c在人腦膠質瘤中的表達研究
　　 目的:探討miRNA-34c在人腦膠質瘤組織中的表達情況。
　　 方法:應用定量PCR方法對18例

8、WHO分級Ⅱ-Ⅳ級的福爾馬林固定石蠟包埋的腦膠質瘤標本和外傷或腦出血患者內減壓手術獲得的5例腦組織標本分別進行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的檢測，比較不同級別膠質瘤和正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達差異，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達和膠質瘤惡性程度的相關性。
　　 結果:與正常腦組織相比，膠質瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達皆顯著減少，而且

9、miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達隨著膠質瘤級別或惡性程度的增加分別減少，呈顯著的負相關（miR-34c-3p的spearman相關系數(shù)=-0.856，P＜0.001; miR-34c-5p的spearman相關系數(shù)=-0.767，P＜0.01)。
　　 結論:MiR-34c在人腦膠質瘤細胞中的表達顯著降低，而且表達隨著腫瘤分級或惡性程度的增高而減少，與膠質瘤級別的升高呈顯著的負相關。MiR-34c在膠質瘤的進展中

10、有重要的意義，可作為腦膠質瘤臨床分級的重要指標。
　　 第二部分上調miR-34c抑制膠質瘤細胞的增殖及侵襲
　　 目的:研究miR-34c對人腦膠質瘤細胞株U251和U87的增殖、遷移、侵襲、凋亡和細胞周期的影響。
　　 方法:應用脂質體將miR-34c導入膠質瘤細胞株U251和U87后，應用定量PCR驗證轉染效果，應用MTS法檢測細胞增殖變化、Transwell小室檢測細胞遷移侵襲能力變化、流式細胞儀檢測細胞

11、凋亡和細胞周期的改變。
　　 結果:在U87和U251細胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達量要明顯小于正常膠質細胞系HEB。而轉染了miR-34c-3p的U87和U251細胞，其miR-34c-3p的表達量明顯高于未轉染組的細胞(Normal組，P＜0.05)和NC組細胞(P＜0.05)，miR-34c-5p也呈同樣的變化。在U251細胞中，轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96小

12、時，細胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)和NC組(P＜0.05)。而在U87細胞中情況有所不同，轉染miR-34c-3p后48、72、96小時，細胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)和NC組(P＜0.05);轉染miR-34c-5p后24、48、72、96小時，細胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)，而與NC組沒有顯著差異(P＞0.05)。利用Transwell小室，U251細胞轉染miR-34c-3p或

13、miR-34c-5p后，其遷移至下室的細胞數(shù)量與Normal組和NC組相比顯著減少，在U87細胞中的情況相同。U251細胞高表達miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87細胞高表達miR-34c-3p可以導致細胞停滯在S期，同時降低了G0/G1期的細胞數(shù)。在U251細胞中，凋亡細胞在Normal組和NC組分別占6.57％和6.3％，而轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡細胞所占比例上升分別占28.49％和28.1

14、4％。但是在U87細胞中有所不同，僅轉染miR-34c-3p后凋亡細胞數(shù)上升(3.56％)，而Normal組，NC組和轉染miR-34c-5p組分別為1.53％，1.68％和1.91％。
　　 結論:轉染上調miR-34c在膠質瘤中的表達能夠抑制其增殖、遷移和侵襲能力，導致細胞周期在S期及G2/M期的停滯，誘導膠質瘤細胞的凋亡，為腦膠質瘤靶向治療提供可靠的依據。但miR-34c-3p與miR34c-5p在不同細胞系中，影響細胞增

15、殖能力、細胞周期變化及誘導細胞凋亡的效果有所不同，推測他們可能是通過不同靶點或機制起作用。
　　 第三部分MiR-34c在膠質瘤細胞中的靶基因及作用機制
　　 目的:探討miR-34c在膠質瘤細胞中作用的下游靶基因及作用機制
　　 方法:通過miRanda、PICTAR、TargetScan三個數(shù)據庫篩選miR-34c的預測靶點，從中找到我們感興趣的基因，再利用定量PCR和Western技術檢測轉染后的膠質瘤細胞

16、該基因的表達情況，最后利用熒光素酶報告基因實驗驗證該感興趣基因確實為miR-34c的下游靶基因。
　　 結果:通過多種數(shù)據庫的篩選，我們最終將感興趣的基因鎖定在Notch2。定量PCR的結果顯示，轉染miR-34c-3p后的Notch2 mRNA的表達量相比Normal組和NC組顯著降低(P＜0.05)，但轉染miR-34c-5p后卻沒有明顯變化。Western blot的結果同樣顯示，U251和U87細胞轉染miR-34c-3

17、p后的Notch2的表達量相比Normal組和NC組降低了15％。而轉染miR-34c-5p后Notch2的表達量沒有顯著變化。在轉染克隆有Notch2基因3'UTR質粒的實驗中，miR-34c-3p組與空白組和NC組相比，熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)，證明miR-34c-3p能與Notch2基因3'UTR結合，從而抑制熒光素酶的活性。miR-34c-3p Inhibitor組與空白組和NCInhibitor組相比，熒光素酶活性

18、顯著升高(P＜0.05)，證明miR-34c-3pInhibitor能封閉內源miR-34c-3p，抑制miR-34c-3p的作用。在轉染克隆有mut Notch2-2基因3'UTR質粒的實驗中，miR-34c-3p組與空白組和NC組均無差異，證明miR-34c-3p不能與mut Notch2-2基因3'UTR結合，抑制熒光素酶的活性，突變完全。在轉染克隆有Notch2基因3'UTR質粒的實驗中，miR-34c-5p組與空白組和NC組均

19、無差異，證明miR-34c-5p不能與Notch2基因3'UTR結合，抑制熒光素酶的活性。同時在轉染克隆有mut Notch2-1基因3'UTR質粒的實驗中，miR-34c-5p組與空白組和NC組均無差異，證明miR-34c-5p不能與mut Notch2-1基因3'UTR結合，抑制熒光素酶的活性。
　　 結論:轉染了miR-34c-3p的膠質瘤細胞其Notch2表達量明顯降低，而轉染miR-34c-5p的沒有顯著變化。利用熒光