MicroRNA-128在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能研究.pdf

1、MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，可以通過結(jié)合到靶基因的3’非編碼區(qū)、5’非編碼區(qū)或者蛋白編碼區(qū)來促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)，其中目前研究最多的調(diào)控方式是它以不完全互補(bǔ)的形式結(jié)合到目的基因的3’非編碼區(qū)，來抑制靶基因的表達(dá)。MiRNA的功能涉及到各個(gè)生理和病理過程中，在人類最常見的腦腫瘤之一——神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中也可能起著舉足輕重的作用。
　　 在本研究中，我們首先選取了9例膠質(zhì)瘤樣本組織(包括II級、III級和IV級各3

2、例)，4株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(T98G、U87、U251、A172)和2例正常腦組織，用real—timePCR的方法檢測了miR—128在其中的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)都明顯低于正常腦組織，而且其表達(dá)和病理分級相關(guān)，病理分級越高，miR—128表達(dá)越低。
　　 將miR—128的成熟序列轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞后，MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測到活細(xì)胞數(shù)減少、增殖減緩，但用hochest染色法沒有觀

3、察到有細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。因此，miR—128可能影響到與細(xì)胞增殖有關(guān)的某個(gè)或某些基因的表達(dá)，但可能不涉及細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)的預(yù)測，我們尋找了相關(guān)的8個(gè)與細(xì)胞增殖或者神經(jīng)分化相關(guān)的基因作為預(yù)選靶基因，包括E2F3a、BMI—1、SOX11等，將它們含有miR—128結(jié)合位點(diǎn)的序列克隆到熒光素酶報(bào)告基因的下游，發(fā)現(xiàn)miR—128可以與E2F3a3’UTR區(qū)的靶位點(diǎn)結(jié)合并抑制其所在報(bào)告基因的表達(dá)。將miR—128轉(zhuǎn)入T98G細(xì)胞，

4、Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測到miR—128可以減少內(nèi)源性E2F3a的蛋白水平，但不影響其mRNA水平。說明E2F3a可能是miR—128在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的一個(gè)靶基因。
　　 E2F3a是一個(gè)細(xì)胞從G1期到S期的調(diào)控因子，E2F3a的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，相反則抑制細(xì)胞的增殖。我們同樣選取了9例膠質(zhì)瘤樣本組織(包括II級、III級和IV級各3例)和2例正常腦組織，從Western Blot實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)E2F3a

5、的表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中要明顯高于正常腦組織，與miR—128的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。合成E2F3a的siRNA序列，抑制其表達(dá)后可以引起與增加miR—128類似的效應(yīng)；而在增加miR—128的同時(shí)過表達(dá)E2F3a又可以部分的挽救由miR—128引起的增殖抑制。進(jìn)一步說明miR—128可能影響到神經(jīng)膠質(zhì)瘤中E2F3a的表達(dá)。同時(shí)表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR—128還調(diào)控除E2F3a外的其它基因的表達(dá)。
　　 為了進(jìn)一步全景式分析miR—12

6、8在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中調(diào)控的靶基因，我們采用pSILAC蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定miR—128在膠質(zhì)瘤中調(diào)控的靶基因。質(zhì)譜結(jié)果共檢測到1700多個(gè)蛋白，其中表達(dá)增加0.5倍以上只檢測到4個(gè)，表達(dá)降低50％以上的檢測到57個(gè)，主要與細(xì)胞的代謝、增殖等有關(guān)。根據(jù)經(jīng)典的miRNA靶位點(diǎn)預(yù)測方式，在這57個(gè)基因中TROVE2、CCNK等7個(gè)基因的mRNA3’UTR區(qū)具有miR—128的結(jié)合位點(diǎn)，它們可能為miR—128的直接靶基因。而其它基因可能與miR