MicroRNA-134靶向Nanog基因調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)活性.pdf

1、目的:研究不同級別膠質(zhì)瘤組織以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中microRNA-134(miR-134)的表達(dá),建立穩(wěn)定表達(dá)miR-134的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,研究miR-134過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nanog的靶向抑制作用,并探索miR-134過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)活性的影響。為后續(xù)進(jìn)一步研究Nanog相關(guān)通路的膠質(zhì)瘤基因靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:①Real-timePCR方法檢測11例正常腦組織(取自顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)患者)、42例不同級

2、別腦膠質(zhì)瘤組織、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251中miR-134的表達(dá)情況。②通過慢病毒包裝的miR-134表達(dá)載體轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞,利用篩選抗生素(滅瘟素,BlasticidinS)持續(xù)篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)miR-134的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,并通過RT-PCR和Westernblotting實驗分別檢測該細(xì)胞株中Nanog的mRNA和蛋白表達(dá)水平。③通過MTT、Transwell細(xì)胞遷移侵襲實驗、細(xì)胞劃痕、流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡、裸鼠成瘤實

3、驗、免疫組織化學(xué)染色等方法檢測miR-134靶向抑制Nanog后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)活性的影響。
　　結(jié)果:①與正常腦組織相比,miR-134在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均明顯下降(均P<0.05)。WHOⅢ~Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中miR-134表達(dá)明顯低于WHOⅠ~Ⅱ級(P<0.05)。與正常腦組織相比,miR-134在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251中的表達(dá)亦顯著降低(均P<0.05)。②通過使用殺稻瘟素(Bsd)持續(xù)篩選20天后,獲得

4、穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的細(xì)胞株,熒光顯微鏡下觀察傳代5次以上的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株可見所有細(xì)胞均穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光。Real-timePCR測得U87-miR-134組與空白對照組及空質(zhì)粒組相比,miR-134水平顯著提高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),空質(zhì)粒組和空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示成功建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株U87-miR-134組和空質(zhì)粒組。進(jìn)一步研究顯示U87

5、-miR-134細(xì)胞中Nanog的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。③與空白對照組及空質(zhì)粒組相比,U87-miR-134膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖水平、侵襲和遷移能力均明顯下調(diào),細(xì)胞凋亡顯著增加;U87-miR-134異位移植瘤的體積與質(zhì)量都明顯小于空白對照組和空質(zhì)粒組細(xì)胞形成的腫瘤,提示裸鼠皮下成瘤能力亦明顯下降(P<0.05)。
　　結(jié)論:①miR-134在膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)。提示miR-134的表達(dá)下調(diào)可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)