人表皮干細胞及眼瞼鱗癌腫瘤干細胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、胚胎的分化發(fā)育研究顯示人體內(nèi)存在干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。這種細胞的存在，使得在遺傳性或嚴(yán)重外傷性疾病中人體器官或組織的再生成為可能。現(xiàn)階段研究表明人表皮干細胞(Epidermal stem cells，ESC)主要存在于皮膚毛囊外根鞘和表皮基底細胞層中。 近年來，隨著正常干細胞研究理論的深入和研究技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者提出腫瘤干細胞(Tumor stem cells，TSC)的概念，認為腫瘤是由腫瘤干細胞增殖分化形成，

2、而腫瘤干細胞起源于正常干細胞的突變。腫瘤干細胞是腫瘤組織內(nèi)具有無限增殖、分化和克隆能力的一小部分細胞，該細胞移植到體內(nèi)后可以形成原發(fā)腫瘤。這部分細胞與正常干細胞一樣，都具有慢周期性和無限增殖的能力。腫瘤干細胞的研究將更新人們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的認識，為目前研究腫瘤的形成提供了新的思路，為治療腫瘤提供了新方法。 一、研究目的：本研究以人胚胎表皮和眼瞼鱗狀細胞癌為研究對象，通過觀察人胚胎表皮的發(fā)育過程，研究人胚胎表皮干細胞的分布

3、及生物學(xué)特性；探討表皮鱗狀細胞癌組織中是否存在腫瘤干細胞并研究其生物學(xué)特性；初步比較表皮干細胞和相關(guān)惡性腫瘤干細胞的異同。這些研究為新的腫瘤發(fā)生機制提供了理論依據(jù)，并為表皮惡性腫瘤的靶向治療打下了基礎(chǔ)。 二、實驗方法： 實驗材料的收集：胚胎組織取自中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院合法流產(chǎn)胎兒，胚齡從8W～38W不等。眼瞼鱗狀細胞癌取自2005年7月～2006年6月期間在中山眼科中心四區(qū)接受手術(shù)的患者，病理診斷由本中心病理室作出。SU

4、NE1鱗狀細胞癌細胞系由中山大學(xué)腫瘤防治中心友情提供。 1 取不同胚齡胚胎全身不同部位皮膚標(biāo)本，作形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)鑒定。 取不同胚齡人皮膚標(biāo)本，用10﹪福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片，每片5μm，HE染色及免疫組化染色。第一抗體有P63， K19，CKAE1/AE3；以PBS替代一抗為陰性對照； 2 取新鮮胚胎皮膚組織進行表皮細胞體外培養(yǎng)及免疫組化鑒定新鮮胚胎皮膚組織經(jīng)含雙抗的PBS液沖洗后，采用組織塊

5、培養(yǎng)法進行人胚胎表皮細胞原代培養(yǎng)，并作原代細胞的免疫組化鑒定。 3 人眼瞼皮膚鱗狀細胞癌形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化鑒定； 取人眼瞼皮膚鱗狀細胞癌標(biāo)本，用10﹪福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，每片5μm，HE染色及免疫組化染色(第一抗體為P63)。 4 人眼瞼皮膚鱗狀細胞癌體外培養(yǎng)及免疫組化鑒定取新鮮人眼瞼皮膚鱗狀細胞癌組織，經(jīng)含雙抗的PBS液沖洗后，采用組織塊培養(yǎng)法進行癌細胞體外培養(yǎng)，并作原代細胞的免疫組化鑒定。

6、 5 SIYNE1鱗狀細胞癌細胞系體外細胞克隆實驗SLYNE1鱗狀細胞癌細胞系由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供。復(fù)蘇SUNE1細胞，按20個/ml，50個/ml，100個/ml的細胞濃度，在10mm直徑細胞培養(yǎng)皿中進行細胞克隆。14天后細胞進行臺盼蘭染色，記數(shù)克隆率。觀察形成的克隆大小，并對克隆分類。 6 SLINE1鱗狀細胞癌細胞系亞細胞群比率流式檢測復(fù)蘇SUNE1細胞。按5×10<'6>細胞濃度，依次用1﹪多聚甲醛固定細胞，破

7、膜劑破膜，PE標(biāo)記的P63抗體對細胞進行熒光染色。流式細胞儀檢測陽性細胞比率。 7 半定量RT-PCR．法檢測SUNE1細胞中表皮發(fā)育基因表達提取SUNE1細胞總RNA，RT-PCR法檢測總RNA中表皮發(fā)育基因P63，PCNA，K1，β1-integrin，K15的表達情況；β-actin作內(nèi)參。 三、實驗結(jié)果 1．人胚胎表皮形態(tài)學(xué)及免疫組化研究9W人胚胎表皮標(biāo)本僅見兩層細胞，深層為立方形的基底細胞，外層為扁平的

8、周皮細胞。胚齡大于10W的標(biāo)本見基底層細胞開始分裂，依次向外長出棘層，顆粒層，透明層和角質(zhì)層細胞；同時，毛發(fā)開始出現(xiàn)。9W左右的標(biāo)本P63染色僅見基底細胞層部分細胞陽性，而10W后，P63染色可見不僅基底細胞層部分細胞，毛囊外根鞘隆突部位部分細胞均顯示陽性。小于10W的標(biāo)本，干細胞只存在于基底細胞層，而10W后的標(biāo)本，干細胞存在于基底細胞層和毛囊外根鞘兩個部位。K19染色可見表皮多層細胞彌漫性陽性，因此可證明K19不適合做為表皮干細胞特

9、異性的標(biāo)記物。CKAE1/AE3染色在表皮多層細胞中均呈陽性，提示這些細胞均已向角質(zhì)細胞分化。 2．人胚胎表皮細胞體外培養(yǎng)干細胞研究原代細胞成多邊型或不規(guī)則型，P63染色見陽性細胞散在分布，取倒置顯微鏡下一個高倍鏡(200×)視野中陽性細胞占細胞總數(shù)的比率(重復(fù)三次)，約為15﹪左右，即認為在表皮細胞原代培養(yǎng)中，干細胞約占15﹪。 3．人眼瞼鱗狀細胞癌形態(tài)學(xué)及免疫組化研究癌細胞向下生長至真皮內(nèi)，呈現(xiàn)不規(guī)則的上皮細胞團塊。

10、細胞較大，胞漿豐富，部分細胞呈空泡狀。可見核分裂像。P63染色可見較多的胞核強陽性細胞，提示腫瘤增殖能力旺盛。 4．人眼瞼鱗狀細胞癌體外原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化研究原代細胞可見細胞較大，多呈不規(guī)則型。細胞核分裂像多見。P63染色見大部分細胞胞核陽性，高倍鏡(200×)視野下陽性細胞率可高達50﹪以上。 5．S15NE1細胞體外克隆實驗研究分別計算細胞濃度為20個/ml，50個/ml及100個/ml下SUNE1細胞的克

11、隆率，均可達到50﹪左右。根據(jù)克隆形成面積大小，可初步將克隆分為大克隆和小克隆。分別做大、小克隆的P63免疫組化鑒定，可見大、小克隆大部分細胞均成陽性染色。 6．流式細胞儀檢測SUNE1細胞亞群比率P63陽性細胞群約占9.8﹪。 7．半定量RT-PCR法檢測S13NE1細胞中表皮分化基因的表達分別檢測SUNE1細胞中P63，CK1，CK15，β1-integrin，PCNA等5種常見表皮細胞分化基因的表達?？梢奝CNA表

12、達最強，CK15次之，P63和β1-integrin表達較弱，CK1未見表達表達。 四、結(jié)論 1．在正常胚胎表皮(包括眼瞼表皮)中有表皮干細胞的存在。 2．在人眼瞼鱗狀細胞癌組織中，同樣有干細胞的存在，即腫瘤干細胞。 3．正常胚胎表皮原代細胞培養(yǎng)P63染色陽性率約為15﹪；而人眼瞼鱗癌原代細胞培養(yǎng)P63染色陽性率高于50﹪。因此表明鱗癌組織中干細胞含量遠遠大于正常表皮組織中干細胞含量。 4．SUN