妊娠期間歇低氧誘導大鼠子代類焦慮樣行為的CRH1型受體表觀遺傳學機制研究.pdf

1、流行病學調查研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期應激可以導致子代多種神經精神類疾病的易感性和行為反應的改變。子代神經與精神類疾病的發(fā)生，往往來源于其胚胎發(fā)育期神經系統(tǒng)的發(fā)育紊亂。這類胎源性疾病發(fā)生的分子機制至今尚不十分清楚，目前認為可能與胚胎發(fā)育內環(huán)境改變與胎兒腦內基因編碼相互作用，發(fā)生如DNA甲基化有密切的關系。
　　 母體妊娠期低氧應激，是有害于胎兒發(fā)育的重要因素之一，其對子代健康有深遠的影響。在高原地區(qū)生活或者妊娠伴有貧血癥、高血壓、呼吸睡眠

2、綜合癥和先兆子癇等疾病時，均會引發(fā)妊娠期胎兒低氧或缺氧。我們實驗室的以往工作顯示，妊娠期間歇低氧可以導致HPA軸敏感化并誘發(fā)子代類焦慮樣行為的出現(xiàn)，這與PVN區(qū)CRHR1受體的激活相關，但是CRHR1激活的分子機制尚未闡明。本論文旨在闡述妊娠期間歇性低氧誘導子代發(fā)生性別依賴性類焦慮樣行為的Crhr1基因表觀遺傳修飾的分子機制。
　　 我們發(fā)現(xiàn)，妊娠期母鼠每天暴露于高原低氧（人工低氣壓艙模擬5km海拔，相當于海平面10.8％ O2

3、）4小時，誘導了成年雄性子代成年大鼠類焦慮樣行為，對雌性無影響。這種作用與生后90天(P90)子代下丘腦PVN區(qū)和胚胎發(fā)育19天(E19)下丘腦中CRHR1 mRNA高表達有關。雌性E19下丘腦CRHR1 mRNA表達下降而CRHR2 mRNA表達升高，這與CRHR1和CRHR2蛋白表達變化相一致，進而發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK1/2蛋白的表達水平也明顯升高。該結果提示，在下丘腦區(qū)，CRHR2可能通過激活Ras-MAPK信號通路參與調控CRHR1

4、的下調。
　　 我們利用qPCR技術檢測了CRHR1和CRHR2的mRNA在子代生后發(fā)育期下丘腦PVN區(qū)、CeA區(qū)和垂體組織中的表達情況。發(fā)現(xiàn)在PVN區(qū)，妊娠期間歇低氧降低P7天雌性子代CRHR1 mRNA的表達水平，對P1至P21天雄性子代無影響。此外，升高P14天雌性子代CRHR2 mRNA水平，對雄性子代無明顯影響。在P7天時，雌性和雄性子代CRHR1∶ CRHR2的比值降低;在垂體組織中，妊娠期間歇低氧明顯降低P1和P1

5、4天雄性子代CRHR1 mRNA的表達，明顯升高P7天雄性子代CRHR2 mRNA表達。同時，P1天雄性子代CRHR1和CRHR2比值下降而雌性子代該比值的升高，P7天雌、雄子代CRHR1和CRHR2比值均下降;在CeA區(qū)，妊娠期間歇低氧降低P1天雄性子代CRHR1 mRNA的表達，升高P14天CRHR1 mRNA的表達，降低P7天雌性子代CRHR1mRNA的表達。妊娠期間歇低氧還可以升高P1天到P14天雌性子代CRHR2 mRNA的表

6、達，但對雄性子代無影響。P1天雌性子代和P21天雄性子代CRHR1和CRHR2比值下降，以及P7和P14天雌雄子代CRHR1和CRHR2比值下降。
　　 此外，我們應用MethPrimer-Design Primers for Methylation PCRs軟件，分析大鼠Crhr1基因啟動子區(qū)CpG島的分布格局，發(fā)現(xiàn)在Crhr1基因的啟動子區(qū)有兩個CpG島（島1和島2），島1位于轉錄起始位點上游的-607到-502bp的區(qū)域，

7、島2則位于第一外顯子區(qū)上游-6到+429bp的區(qū)域。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，島1是調節(jié)Crhr1基因轉錄活性的主要調控區(qū)域。之后，我們對啟動子區(qū)起主要調控作用的島1內9個CG位點的甲基化修飾水平進行了檢測，結果顯示;E19天的雄性子代下丘腦區(qū)-535位胞嘧啶的甲基化修飾水平明顯降低，這與雄性子代CRHR1mRNA表達升高相一致，而E19天雌性子代-547位胞嘧啶的甲基化修飾水平明顯升高，這與CRHR1 mRNA表達降低相一致。在生后

8、發(fā)育期和成年期，在P1、P14和P90天的雄性子代PVN區(qū)，始終存在-535位CG位點的甲基化修飾水平的下降，同時妊娠期間歇低氧還可以導致P90天雄性子代PVN區(qū)Crhr1基因-587、-561、-547和-544位胞嘧啶甲基化修飾水平的下降，但對雌性子代Crhr1基因的9個CG位點的甲基化水平無影響。在垂體組織中，妊娠期間歇低氧明顯降低P1天雄性子代-547、-544和-535位胞嘧啶的甲基化修飾水平和升高P1天雌性子代-544位胞嘧

9、啶，P14和P90天-561位胞嘧啶的甲基化修飾水平。在CeA區(qū)，妊娠期間歇低氧可以明顯升高P1天雌雄子代-552、-547、-544和-535位CG位點的甲基化水平，并且僅明顯升高P90雄性子代-579、-552和-547位CG位點的甲基化水平。此外，P90天PVN區(qū)和E19天下丘腦組織內Crhr1基因CG位點甲基化修飾水平改變主要受該組織中DNA甲基轉移酶3b(DNMT3b)的調控。細胞實驗顯示，Crhr1基因啟動子區(qū)-547位CG

10、位點的突變可以降低該基因的基礎轉錄活性，這意味著該位點的堿基序列可能是影響轉錄因子與Crhr1基因結合的關鍵區(qū)域。另外，-604位、-587位、-579位、-547位、-544位和-535位突變載體的甲基化修飾不會再引起Crhr1基因的轉錄調控的下調，而-561位、-552位和-537位突變載體的甲基化修飾依然可以下調Crhr1基因的轉錄調控活性活性，由此可見，-604位、-587位、-579位、-547位、-544位和-535位的CG

11、位點是影響CRHR1表達的主要位點。提示發(fā)育期間的Crhr1基因甲基化修飾可能受多種因素的調節(jié)，胎源起因是其中之一，同時也受到生后發(fā)育生理調節(jié)和環(huán)境變遷的復雜作用。
　　 綜上所述，妊娠期間歇低氧可以誘導子代類焦慮樣行為的出現(xiàn)，并且這種行為學改變具有雄性特異性特點以及PVN區(qū)CRHR1 mRNA高表達的性別依賴性特點，提示兩者有相關性。妊娠期間歇低氧降低DNMT3b的表達，可能是低氧上調Crhr1基因表達的機制之一，也是Crhr