妊娠早期高雌激素暴露對子代甲狀腺激素的影響及其表觀遺傳機制研究.pdf

1、本文從以下三部分進行論述：
　　第一部分 妊娠早期高雌激素暴露子代的隨訪研究
　　目的:研究妊娠早期高雌激素環(huán)境暴露的子代的甲狀腺功能狀況，比較分析母親妊娠時期的雌激素水平與甲狀腺激素水平的相關性，明確宮內高雌環(huán)境所致成年期疾病的發(fā)病風險。
　　方法:對949名3-10歲的兒童甲狀腺功能指標（T3，F(xiàn)T3，T4，F(xiàn)T4和TSH）進行了橫斷面研究，其中包括新鮮胚胎移植周期出生的IVF子代（Fresh ET組）357名，冷

2、凍胚胎移植周期出生的IVF子代（Frozen ET組）212名，以及自然妊娠出生子代（NC組）380名。隨訪的指標包括子代的基本情況，其母親妊娠時期的情況，以及子代的血壓、心率、甲狀腺激素、血常規(guī)等指標。通過病案系統(tǒng)回顧性查閱了2012年10月至2013年1月在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院進行輔助生殖治療妊娠以及自然妊娠約4-12周時母親外周血（單胎妊娠）的雌激素水平。此外，我們還檢測了183名新生兒臍帶血的甲狀腺激素水平，其中包括Fr

3、esh ET組55名，F(xiàn)rozen ET組48名以及NC組80名，通過病案系統(tǒng)回顧性查閱了其母親HCG日的雌激素水平。
　　結果:排除出生體重、出生身長、孕周、性別、月齡、體重指數(shù)以及母親妊娠年齡等干擾因素后，自然妊娠組、新鮮胚胎移植組和冷凍胚胎移植組子代的血常規(guī)指標、血壓、心率無顯著性差異，而子代甲狀腺激素水平出現(xiàn)改變。Frozen ET組選取的均是自然周期進行凍融胚胎移植而出生的IVF子代，其母體雌激素水平為生理水平，與NC組

4、沒有顯著差異，而Fresh ET組在孕早期各個時間點的母體雌激素水平遠高于Frozen ET組和NC組。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)resh ET組的T4，F(xiàn)T4和TSH水平顯著高于NC組，F(xiàn)rozen ET組由于避開了宮內高雌激素環(huán)境，除FT4水平介于Fresh ET組和NC組之外，T4和TSH水平跟NC組相比均沒有顯著性差異。同時，相比于NC組，F(xiàn)resh ET組中FT4和TSH超過正常值上限的比例明顯增加，提示發(fā)生甲狀腺疾病的風險增加。在臍血中我

5、們也發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，F(xiàn)resh ET組的T4，F(xiàn)T4和TSH顯著增高，而Frozen ET組的T4和TSH接近于對照組。進一步分析發(fā)現(xiàn)通過Fresh ET出生的新生兒T4、FT4水平和母體hCG日的雌激素水平呈顯著正相關。
　　結論:促排卵治療的孕婦在妊娠早期處于一種超生理范圍的高雌激素狀態(tài)，是研究宮內高雌激素暴露的優(yōu)選模型。在胚胎發(fā)育過程中，超生理濃度的雌二醇水平會增加IVF子代甲狀腺功能異常的風險。冰凍胚胎移植由于避開了宮

6、內高雌激素環(huán)境，可以降低其出生子代甲狀腺疾病風險。
　　第二部分 宮內高雌環(huán)境出生子代小鼠甲狀腺功能及甲基化狀況
　　目的:研究宮內高雌環(huán)境出生子代小鼠的生長發(fā)育及甲狀腺功能狀況，明確宮內高雌環(huán)境所致成年期疾病的發(fā)病風險。
　　方法:建立妊娠期宮內高雌小鼠模型，雌激素給藥組小鼠在妊娠第5-11天給予戊酸雌二醇，并收集妊娠第18天，出生后3周和8周的甲狀腺、血液等標本。檢測對照組(C)與高雌出生子代出生體重、3周齡及8周

7、齡體重;放免法檢測出生子代甲狀腺激素水平;ELISA試劑盒檢測給藥后孕鼠體內雌激素水平;HE染色觀察甲狀腺形態(tài);熒光定量PCR和免疫組化檢測相關基因表達;亞硫酸氫鹽測序檢測pax8啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平;體外研究17β-雌二醇對甲狀腺濾泡細胞增殖的影響以及甲狀腺轉錄因子pax8和甲基轉移酶Dnmt3a的表達調控。
　　結果:妊娠時間和每窩出生仔數(shù)各組沒有顯著差異，但高雌組的妊娠率明顯降低。此外高雌劑量組出生的子代雌鼠的體重在

8、0-5周明顯低于對照組，雄鼠跟對照組相比沒有顯著性差異。高雌劑量組出生的子代雌鼠在3周和8周時，T4和FT4顯著高于對照組;高雌劑量組出生的子代雄鼠在3周時T4顯著高于對照組，8周時跟對照組相比，沒有顯著性差異。熒光定量PCR和免疫組化結果顯示，高雌組子代的Pax8和Tpo表達明顯上調。進一步研究發(fā)現(xiàn)在高雌給藥組出生的子代小鼠中，pax8基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平明顯低于對照組。同時，Dnmt3a和Mbd1基因的表達要明顯低于對照

9、組。此外，在體外試驗中，雌激素能夠濃度依賴性地促進甲狀腺濾泡細胞系的增殖，以及上調pax8基因和下調Dnmt3a基因。
　　結論:在孕早期胎兒甲狀腺發(fā)育的敏感時期，高濃度的雌激素暴露，有可能會改變甲狀腺功能相關基因的甲基化狀態(tài)，進而使得出生子代出現(xiàn)甲狀腺功能的異常。
　　第三部分 長鏈非編碼RNA在高雌激素暴露的甲狀腺細胞中表觀遺傳調控的研究
　　目的:研究高雌激素暴露對甲狀腺濾泡細胞長鏈非編碼RNA（lncRNA）表

10、達譜的影響。篩選與甲狀腺功能相關的lncRNA，驗證其生物學功能并探討相關分子機制，評估lncRNA在高雌激素致甲狀腺功能異常發(fā)生發(fā)展中的作用，明確可以預測宮內高雌所致成年期疾病發(fā)生的長鏈非編碼RNA。
　　材料和方法:選取雌激素處理組和對照組甲狀腺濾泡細胞各3例，進行l(wèi)ncRNAs表達芯片分析。采用實時定量PCR方法在雌激素處理的甲狀腺濾泡細胞系中驗證差異明顯的6個lncRNAs。利用生物信息學對芯片結果進行分析，篩選目標lnc

11、RNA，并在nthy ori3-1細胞上采用實時定量PCR方法驗證雌激素處理后其表達的變化。應用小于擾RNA特異性降低lnc DSG1的表達后，觀察mdm2及甲狀腺細胞增殖的變化。
　　結果:我們篩選得到在高雌暴露的甲狀腺濾泡細胞中差異表達的188個lncRNAs，其中上調表達的lncRNAs111個，下調表達的lncRNAs78個。我們在nthy ori3-1細胞中驗證了6個差異顯著的lncRNAs，與芯片的結果一致，證實了芯片

12、結果的可靠性。CNC網(wǎng)絡圖提示lnc DSG1可能影響甲狀腺功能。進一步細胞實驗也證實雌激素可以上調lnc DSG1和MDM2基因的表達，而加入干擾lnc DSG1后可以下調MDM2的表達并抑制甲狀腺濾泡細胞的增殖。
　　結論:高雌激素暴露的環(huán)境可導致lncRNAs表達譜的改變，雌激素上調lncRNADSG1的表達，促進MDM2的表達。而加入干擾lncRNA DSG1下調MDM2的表達并抑制甲狀腺濾泡細胞的增殖。lncRNA DS