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文檔簡介
1、本文從以下三部分進行論述:
第一部分 妊娠早期高雌激素暴露子代的隨訪研究
目的:研究妊娠早期高雌激素環(huán)境暴露的子代的甲狀腺功能狀況,比較分析母親妊娠時期的雌激素水平與甲狀腺激素水平的相關性,明確宮內高雌環(huán)境所致成年期疾病的發(fā)病風險。
方法:對949名3-10歲的兒童甲狀腺功能指標(T3,F(xiàn)T3,T4,F(xiàn)T4和TSH)進行了橫斷面研究,其中包括新鮮胚胎移植周期出生的IVF子代(Fresh ET組)357名,冷
2、凍胚胎移植周期出生的IVF子代(Frozen ET組)212名,以及自然妊娠出生子代(NC組)380名。隨訪的指標包括子代的基本情況,其母親妊娠時期的情況,以及子代的血壓、心率、甲狀腺激素、血常規(guī)等指標。通過病案系統(tǒng)回顧性查閱了2012年10月至2013年1月在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院進行輔助生殖治療妊娠以及自然妊娠約4-12周時母親外周血(單胎妊娠)的雌激素水平。此外,我們還檢測了183名新生兒臍帶血的甲狀腺激素水平,其中包括Fr
3、esh ET組55名,F(xiàn)rozen ET組48名以及NC組80名,通過病案系統(tǒng)回顧性查閱了其母親HCG日的雌激素水平。
結果:排除出生體重、出生身長、孕周、性別、月齡、體重指數(shù)以及母親妊娠年齡等干擾因素后,自然妊娠組、新鮮胚胎移植組和冷凍胚胎移植組子代的血常規(guī)指標、血壓、心率無顯著性差異,而子代甲狀腺激素水平出現(xiàn)改變。Frozen ET組選取的均是自然周期進行凍融胚胎移植而出生的IVF子代,其母體雌激素水平為生理水平,與NC組
4、沒有顯著差異,而Fresh ET組在孕早期各個時間點的母體雌激素水平遠高于Frozen ET組和NC組。我們發(fā)現(xiàn),F(xiàn)resh ET組的T4,F(xiàn)T4和TSH水平顯著高于NC組,F(xiàn)rozen ET組由于避開了宮內高雌激素環(huán)境,除FT4水平介于Fresh ET組和NC組之外,T4和TSH水平跟NC組相比均沒有顯著性差異。同時,相比于NC組,F(xiàn)resh ET組中FT4和TSH超過正常值上限的比例明顯增加,提示發(fā)生甲狀腺疾病的風險增加。在臍血中我
5、們也發(fā)現(xiàn),相比于對照組,F(xiàn)resh ET組的T4,F(xiàn)T4和TSH顯著增高,而Frozen ET組的T4和TSH接近于對照組。進一步分析發(fā)現(xiàn)通過Fresh ET出生的新生兒T4、FT4水平和母體hCG日的雌激素水平呈顯著正相關。
結論:促排卵治療的孕婦在妊娠早期處于一種超生理范圍的高雌激素狀態(tài),是研究宮內高雌激素暴露的優(yōu)選模型。在胚胎發(fā)育過程中,超生理濃度的雌二醇水平會增加IVF子代甲狀腺功能異常的風險。冰凍胚胎移植由于避開了宮
6、內高雌激素環(huán)境,可以降低其出生子代甲狀腺疾病風險。
第二部分 宮內高雌環(huán)境出生子代小鼠甲狀腺功能及甲基化狀況
目的:研究宮內高雌環(huán)境出生子代小鼠的生長發(fā)育及甲狀腺功能狀況,明確宮內高雌環(huán)境所致成年期疾病的發(fā)病風險。
方法:建立妊娠期宮內高雌小鼠模型,雌激素給藥組小鼠在妊娠第5-11天給予戊酸雌二醇,并收集妊娠第18天,出生后3周和8周的甲狀腺、血液等標本。檢測對照組(C)與高雌出生子代出生體重、3周齡及8周
7、齡體重;放免法檢測出生子代甲狀腺激素水平;ELISA試劑盒檢測給藥后孕鼠體內雌激素水平;HE染色觀察甲狀腺形態(tài);熒光定量PCR和免疫組化檢測相關基因表達;亞硫酸氫鹽測序檢測pax8啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平;體外研究17β-雌二醇對甲狀腺濾泡細胞增殖的影響以及甲狀腺轉錄因子pax8和甲基轉移酶Dnmt3a的表達調控。
結果:妊娠時間和每窩出生仔數(shù)各組沒有顯著差異,但高雌組的妊娠率明顯降低。此外高雌劑量組出生的子代雌鼠的體重在
8、0-5周明顯低于對照組,雄鼠跟對照組相比沒有顯著性差異。高雌劑量組出生的子代雌鼠在3周和8周時,T4和FT4顯著高于對照組;高雌劑量組出生的子代雄鼠在3周時T4顯著高于對照組,8周時跟對照組相比,沒有顯著性差異。熒光定量PCR和免疫組化結果顯示,高雌組子代的Pax8和Tpo表達明顯上調。進一步研究發(fā)現(xiàn)在高雌給藥組出生的子代小鼠中,pax8基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平明顯低于對照組。同時,Dnmt3a和Mbd1基因的表達要明顯低于對照
9、組。此外,在體外試驗中,雌激素能夠濃度依賴性地促進甲狀腺濾泡細胞系的增殖,以及上調pax8基因和下調Dnmt3a基因。
結論:在孕早期胎兒甲狀腺發(fā)育的敏感時期,高濃度的雌激素暴露,有可能會改變甲狀腺功能相關基因的甲基化狀態(tài),進而使得出生子代出現(xiàn)甲狀腺功能的異常。
第三部分 長鏈非編碼RNA在高雌激素暴露的甲狀腺細胞中表觀遺傳調控的研究
目的:研究高雌激素暴露對甲狀腺濾泡細胞長鏈非編碼RNA(lncRNA)表
10、達譜的影響。篩選與甲狀腺功能相關的lncRNA,驗證其生物學功能并探討相關分子機制,評估lncRNA在高雌激素致甲狀腺功能異常發(fā)生發(fā)展中的作用,明確可以預測宮內高雌所致成年期疾病發(fā)生的長鏈非編碼RNA。
材料和方法:選取雌激素處理組和對照組甲狀腺濾泡細胞各3例,進行l(wèi)ncRNAs表達芯片分析。采用實時定量PCR方法在雌激素處理的甲狀腺濾泡細胞系中驗證差異明顯的6個lncRNAs。利用生物信息學對芯片結果進行分析,篩選目標lnc
11、RNA,并在nthy ori3-1細胞上采用實時定量PCR方法驗證雌激素處理后其表達的變化。應用小于擾RNA特異性降低lnc DSG1的表達后,觀察mdm2及甲狀腺細胞增殖的變化。
結果:我們篩選得到在高雌暴露的甲狀腺濾泡細胞中差異表達的188個lncRNAs,其中上調表達的lncRNAs111個,下調表達的lncRNAs78個。我們在nthy ori3-1細胞中驗證了6個差異顯著的lncRNAs,與芯片的結果一致,證實了芯片
12、結果的可靠性。CNC網(wǎng)絡圖提示lnc DSG1可能影響甲狀腺功能。進一步細胞實驗也證實雌激素可以上調lnc DSG1和MDM2基因的表達,而加入干擾lnc DSG1后可以下調MDM2的表達并抑制甲狀腺濾泡細胞的增殖。
結論:高雌激素暴露的環(huán)境可導致lncRNAs表達譜的改變,雌激素上調lncRNADSG1的表達,促進MDM2的表達。而加入干擾lncRNA DSG1下調MDM2的表達并抑制甲狀腺濾泡細胞的增殖。lncRNA DS
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