母體甲基供體缺乏對子代小鼠實驗性結腸炎的影響及可能的表觀遺傳學機制研究.pdf

1、目的：
　　潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性、反復發(fā)作性的結直腸連續(xù)性黏膜炎癥性疾病，多以年輕患者多發(fā)。但其發(fā)病機制仍不明確。目前，認為UC是一種多因素、異質性、多基因遺傳的疾病，多種因素包括環(huán)境、遺傳、感染、免疫、腸道微生物等相互作用的結果。近年來發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學是環(huán)境與遺傳因素之間的橋梁，其中DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，它能夠調節(jié)哺乳動物細胞的正常發(fā)育、分化，基因表達和染色質結構。D

2、NA甲基化需要甲基供體，包括葉酸、膽堿、B族維生素和甲硫氨酸。DNA高甲基化與基因沉默相關，而低甲基化則基因表達活躍。研究發(fā)現(xiàn)在UC患者腸道T淋巴細胞中，IFN-γ表達增加與甲基化水平降低相關，而且IFN-γ基因（IFNG）甲基化水平在調節(jié)黏膜細胞因子分泌中有重要作用。眾多證據(jù)表明在哺乳動物發(fā)育過程中，妊娠期和新生兒期的環(huán)境因素通過影響表觀遺傳修飾，導致表型的永久性改變。因此，改變母體飲食因素可能通過影響DNA甲基化參與UC發(fā)生、發(fā)展。

3、本研究以BALC/c鼠為研究對象，通過給予母鼠甲基供體缺乏飲食，構建子代小鼠實驗性結腸炎模型，并檢測血清葉酸、維生素B12和同型半胱氨酸水平，結腸黏膜IFN-γ表達水平，以及IFNG啟動子區(qū)DNA甲基化水平，探討母體甲基供體缺乏是否通過影響DNA甲基化從而參與UC的發(fā)病過程。
　　方法：
　　1.動物模型建立：7周齡BALB/c雌鼠在孕前1個月開始分別喂養(yǎng)標準飲食（C， n=3）和甲基供體缺乏飲食（D，即無葉酸、膽堿、維生素

4、B12和甲硫氨酸， n=4），持續(xù)到子代斷乳（即出生后21天）；子代小鼠與母鼠相同飲食直到被處死。子鼠出生后第23天，造模組以2.5％葡聚糖硫酸鈉溶液（DSS）作為飲用水5天，飲食水量不限。子代小鼠分組如下：C/DSS-組、D/DSS-組、C/DSS+組、D/DSS+組，每組6只。
　　2.結腸炎疾病活動指數(shù)（DAI）：每日觀察子代小鼠身體狀況、體質量、糞便性狀、肛周紅腫糜爛和便血程度。根據(jù)體重減輕程度、糞便性狀和便血程度評分，分

5、數(shù)范圍0-4分，根據(jù)DAI=總分數(shù)/3（0-4），評估結腸炎癥程度。
　　3.采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測子代小鼠外周靜脈血清葉酸、維生素B12和同型半胱氨酸（Hcy）水平。
　　4.采用免疫組織化學SP法檢測子代小鼠結腸黏膜組織中IFN-γ的表達水平。
　　5.提取結腸組織樣本基因組 DNA，經(jīng)過亞硫酸鹽轉化，采用 Sequenom MassArray甲基化檢測方法檢測IFNG啟動子區(qū)CpG島甲基化水平。

6、r>　　結果：
　　1.甲基供體缺乏的證據(jù)：與標準飲食組（C/DSS-和C/DSS+組）相比，甲基供體缺乏飲食組（D/DSS-和D/DSS+組）小鼠的血清葉酸（8.87±1.11比11.34±0.31 nmol/L，P<0.01)、維生素B12（409.2±56.27比676.1±51.66 ng/L，P<0.01）水平均顯著降低；同型半胱氨酸（8.45±0.35比6.77±0.36μmol/L，P<0.01）水平顯著增高。

7、>　　2.甲基供體缺乏對DAI和組織學評分的影響：在DSS處理后第5天，結腸炎癥程度最高。C/DSS+組較C/DSS-組的DAI高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D/DSS+組較C/DSS+組的DAI增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）,表明甲基供體缺乏飲食更加加重了小鼠結腸炎；C/DSS-組和D/DSS-組的DAI無統(tǒng)計學差異。D/DSS-組組織學評分高于C/DSS-組，D/DSS+組明顯高于C/DSS+組，也表明甲基供體缺乏飲

8、食加重了小鼠結腸炎。
　　3.小鼠結腸黏膜組織IFN-γ的表達水平：C/DSS+組和D/DSS+組IFN-γ表達水平較C/DSS-組和D/DSS-組顯著增高（2=14.875，P<0.01），而且D/DSS+組較C/DSS+組增高更明顯（P<0.01）。
　　4.小鼠結腸黏膜組織IFN-γ表達水平與DAI的相關性：C/DSS+組和D/DSS+組的IFN-γ表達水平與DAI呈正相關（r=0.853、0.840，P均<0.05）

9、。
　　5. IFNG啟動子區(qū)CpG島甲基化水平：對同一CpG位點四組樣本之間甲基化水平分析未發(fā)現(xiàn)明顯差異，對四組樣本之間所有CpG位點總甲基化水平分析也未發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　結論：
　　1.母體甲基供體缺乏能夠加劇子代小鼠實驗性結腸炎發(fā)病。
　　2.甲基供體缺乏飲食可以引起子代結腸黏膜IFN-γ表達增高，參與實驗性結腸炎發(fā)病。
　　3.甲基供體缺乏并非通過 IFNG啟動子區(qū) CpG島低甲基化，從而導致 I