鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平片毒代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平片為新的復(fù)方降壓藥。本課題采用目前國(guó)內(nèi)外新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)研究模式對(duì)該藥進(jìn)行了臨床前毒代動(dòng)力學(xué)研究。課題通過(guò)建立同時(shí)測(cè)定血漿中貝那普利、活性代謝物貝那普利拉及樂(lè)卡地平濃度的HPLC-MS/MS測(cè)定方法，對(duì)鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平片在大鼠和犬體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)研究，考察長(zhǎng)期給藥藥物在體內(nèi)是否蓄積，為該復(fù)方制劑的研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。
　　目的：1.建立靈敏度高、專屬性強(qiáng)、高通量的HPLC-MS/MS分析方法，同時(shí)

2、測(cè)定血漿中貝那普利、貝那普利拉及樂(lè)卡地平的濃度。2.檢測(cè)鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平重復(fù)給藥在Beagle犬和大鼠體內(nèi)的暴露和蓄積情況，結(jié)合出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，預(yù)測(cè)臨床毒性靶器官、確定無(wú)毒反應(yīng)劑量、毒性反應(yīng)劑量等，并與單方制劑進(jìn)行比較。
　　方法：1.血漿樣品采用乙腈沉淀蛋白法處理。選用格列齊特和烏苯美司為內(nèi)標(biāo)。色譜柱為Poroshell120 SB-C18（3.0×100mm2.7-Micron）;流動(dòng)相:0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，

3、采用梯度洗脫，梯度:0～1.5min，A:65％;2min，A:30％;2～4.5min，A:30％;5min，A:65％;5～6.5min，A:65％;流速:0.5mL/min;柱溫30℃。ESI源，正離子模式。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，貝那普利m/z425.3→351.1，貝那普利拉m/z397.1→351.1，樂(lè)卡地平m/z612.3→280.2，內(nèi)標(biāo)格列齊特m/z324.1→127.2，烏苯美司m/z309.2→119.9。

4、r>　　2.研究采用直接給予原料藥的方法進(jìn)行，鹽酸樂(lè)卡地平與鹽酸貝那普利的原料比為1∶3，劑量表示為（鹽酸樂(lè)卡地平+鹽酸貝那普利）。Beagle犬經(jīng)口給予鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(6+18)、(20+60)、(60+180)mg/kg/d、單方鹽酸樂(lè)卡地平60mg/kg/d和單方鹽酸貝那普利180mg/kg/d，每周給藥6天，每天給藥1次，連續(xù)給藥39周。在給藥后第1和274天時(shí)取血。取血點(diǎn)為藥前及藥后0.33、0.67、1、2、3、4、7

5、、10、13、24和36h。大鼠灌胃給予鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(4+12)、(13+39)、(40+120)mg/kg/d、單方鹽酸樂(lè)卡地平40mg/kg/d和單方鹽酸貝那普利120mg/kg/d，每周給藥6天，每天給藥1次，連續(xù)給藥26周。在給藥第1和183天時(shí)取血。取血點(diǎn)為藥前及藥后0.25、0.5、1、2、3、5、7、9、12和24 h。采用HPLC-MS/MS測(cè)定Beagle犬血漿中樂(lè)卡地平、貝那普利及其活性代謝產(chǎn)物貝那普利拉的濃

6、度，采用DAS2.1.1實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)程序計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：1.Beagle犬方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果:貝那普利、貝那普利拉和樂(lè)卡地平的線性范圍分別為12～12000ng/mL、12～12000ng/mL和0.6～600ng/mL。貝那普利、貝那普利拉和樂(lè)卡地平的定量下限分別為12、12、0.6ng/mL。日內(nèi)日間精密度RSD均小于15％，犬血漿樣品-80℃放置162天及處理后室溫放置17h穩(wěn)定。貝那普利回收率90.2％～96.

7、8％，基質(zhì)效應(yīng)94.5％～103.8％，貝那普利拉回收率79％～82.7％，基質(zhì)效應(yīng)94.7％～104.4％，樂(lè)卡地平回收率87.5％～103.0％，基質(zhì)效應(yīng)97.55％～107.8％。
　　2.大鼠血漿方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果:貝那普利、貝那普利拉和樂(lè)卡地平的線性范圍分別為0.8～800ng/mL、12～12000ng/mL和1.5～1350ng/mL。貝那普利、貝那普利拉和樂(lè)卡地平的定量下限分別為0.8、12、1.5ng/mL。日內(nèi)日間

8、精密度RSD均小于15％，大鼠血漿樣品-80℃放置149天穩(wěn)定。
　　3.Beagle犬口服給予鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(6+18)mg/kg/d，動(dòng)物無(wú)異常反應(yīng)，(20+60)、(60+180)mg/kg/d劑量與鹽酸樂(lè)卡地平60mg/kg/d、鹽酸貝那普利180mg/kg/d出現(xiàn)稀便、嘔吐、食量減少、牙齦增生;ALT、TBIL、TG升高，尿液膽紅素陽(yáng)性;腎臟腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞扁平。與兩單方組比較，組方后鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平未出現(xiàn)

9、新的毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平高劑量可導(dǎo)致部分犬肝臟和腎臟出現(xiàn)組織病理學(xué)的改變。
　　Beagle犬第一天給藥后，鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(6+18)、(20+60)、(60+180)mg/kg/d三個(gè)劑量組貝那普利的AUC0-t分別為:4276.6±2636.3、12343.6±3319.9、35643.0±7163.1μg/L·h;貝那普利拉的AUC0-t分別為:22171.3±8448.2、70660.1±23362.

10、9、409848.3±98893.7μg/L·h;樂(lè)卡地平的AUC0-t分別為:125.6±79.9、283.9±162.3、662.2±319.3μg/L·h。單方鹽酸樂(lè)卡地平60mg/kg/d樂(lè)卡地平的AUC0-t為:369.1±298.1μg/L·h。單方鹽酸貝那普利180 mg/kg/d，貝那普利的AUC0-t為:27031.9±9235.4μg/L·h;貝那普利拉的AUC0-t為:284450.5±86289.2μg/L·h。

11、
　　第274天給藥后，鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(6+18)、(20+60)、(60+180)mg/kg/d三個(gè)劑量組貝那普利的AUC0-t分別為:3837.9±1944.7、14498.2±7456.1、33241.2±9815.2μg/L·h;貝那普利拉的AUC0-t分別為:10086.6±2432.0、60389.8±34442.9、280135.8±72457.3μg/L·h;樂(lè)卡地平的AUC0-t分別為:130.3±104.

12、2、790.9±386.1、1853.7±1427.5μg/L·h。單方鹽酸樂(lè)卡地平60mg/kg/d樂(lè)卡地平的AUC0-t為:1939.1±1649.4μg/L·h。單方鹽酸貝那普利180mg/kg/d，貝那普利的AUC0-t為:30629.9±5465.9μg/L·h;貝那普利拉的AUC0-t為:237418.4±66054.8μg/L·h。((6+18)、(20+60)和(60+180) mg/kg)三個(gè)劑量和單方鹽酸貝那普利(1

13、80mg/kg/d)、單方鹽酸樂(lè)卡地平（60mg/kg/d），給藥274天與首次給藥貝那普利AUC比值分別為1.0、1.3、1.0和1.3;貝那普利拉AUC比值分別為0.5、1.0、0.7和0.9;樂(lè)卡地平AUC比值分別為1.1、3.7、3.9和10.5。
　　4.大鼠口服給予鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(4+12)mg/kg/d，動(dòng)物無(wú)異常反應(yīng)，(13+39)(40+120)mg/kg/d劑量與鹽酸樂(lè)卡地平40mg/kg/d、鹽酸貝那普

14、利120mg/kg/d均可導(dǎo)致血液生化指標(biāo)異常;復(fù)方降壓藥JY17(40+120)mg/kg/d、鹽酸樂(lè)卡地平40mg/kg/d劑量可引起SD大鼠腎臟組織病理學(xué)改變。
　　貝那普利在大鼠體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物貝那普利拉，血漿中幾乎檢測(cè)不到原形藥物貝那普利。大鼠第一天給藥后，鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平(4+12)、(13+39)、(40+120)mg/kg/d三個(gè)劑量組貝那普利拉的AUC0-t分別為:10189.6±6609、3095

15、4.7±14906.1、97434.9±18599.8μg/L·h;樂(lè)卡地平的AUC0-t分別為:1653.7±540.7、4391.4±1506.7、12553.9±3143.6μg/L·h。單方鹽酸樂(lè)卡地平40mg/kg/d樂(lè)卡地平的AUC0-t為:17302.5±4095.5μg/L·h。單方鹽酸貝那普利120mg/kg/d，貝那普利拉的AUC0-t為:42329.7±15679.7μg/L·h。
　　第183天給藥后，鹽酸

16、貝那普利樂(lè)卡地平(4+12)、(13+39)、(40+120)mg/kg/d三個(gè)劑量組貝那普利拉的AUC0-4分別為:17849.5±6241.5、41423.6±13415.3、101125.6±23839.8μg/L·h;樂(lè)卡地平的AUC0-t分別為:1509.2±786.2、6444.4±1068.1、19625.2±6899.2μg/L·h。單方鹽酸樂(lè)卡地平40mg/kg/d樂(lè)卡地平的AUC0-t為:18579.1±3855.2

17、μg/L·h。單方鹽酸貝那普利120mg/kg/d，貝那普利拉的AUC0-t為:114166.6±22773.8μg/L·h。
　　((4+12)、(13+39)和(40+120)mg/kg)三個(gè)劑量和單方鹽酸貝那普利(120mg/kg/d)、單方鹽酸樂(lè)卡地平(40mg/kg/d)，給藥183天與首次給藥貝那普利拉AUC比值分別為1.8、1.3、1.0和2.7;樂(lè)卡地平AUC比值分別為0.9、1.5、1.6和1.1。
　　結(jié)

18、論：1.本法的精密度、準(zhǔn)確度、專屬性和定量線性范圍均符合體內(nèi)藥物分析的要求。該方法適合鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平片毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究。2.鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平片在Beagle犬和大鼠體內(nèi)均呈線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程。Beagle犬連續(xù)274天口服鹽酸貝那普利樂(lè)卡地平后貝那普利和貝那普利活性代謝產(chǎn)物貝那普利拉在Beagle犬體內(nèi)均不引起蓄積;樂(lè)卡地平劑量大于6mg/kg/d時(shí)在Beagle犬體內(nèi)可能引起蓄積。高劑量樂(lè)卡地平可以起貝那普利、貝那普利拉暴露量