NEDD9在肝癌中的表達及其與肝癌細胞生物學特性之間關系的研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝細胞肝癌（HCC）的發(fā)病率逐年上升，目前，在世界范圍內，它已經是處于第二位的癌癥致死原因，每年大約有800000的肝癌患者死亡。肝癌的根治性治療手段包括根治性肝癌切除、肝臟移植和經皮肝癌射頻消融術，除此之外的選擇性肝動脈栓塞化療（TACE）、放射性栓塞以及系統(tǒng)的全身化療都是姑息性治療手段。在臨床工作中，醫(yī)務工作者們往往根據患者的腫瘤特征、腫瘤分期以及患者身體狀況采取個性化的治療方案。其中只有早期肝癌患者適合采取根治性治療手

2、段，其5年生存率也相應較高，能夠達到75％。通常來說，當有癥狀時發(fā)現的肝癌往往已經有了沿脈管系統(tǒng)的侵犯或者腫瘤體積過大，15%的肝癌患者診斷時已經有了肝外轉移，最常見的轉移器官包括肺臟、腹腔淋巴結、骨和腎上腺，這些患者只能采取姑息性治療手段。但是無論是早期肝癌患者還是晚期肝癌患者，困擾臨床醫(yī)生的一個問題是患者在治療過程中或治療后不久就出現了肝內或者其它遠處臟器的復發(fā)和轉移。既往的研究已經表明，肝癌的復發(fā)和轉移是一個包含多個關鍵分子、多條

3、信號通路的多步驟生物學過程，在此過程中，腫瘤細胞會經歷一個多基因的變化過程，從而導致其增殖潛能增加，凋亡耐受以及轉移能力的增強。因此，探索尋找與肝癌復發(fā)轉移相關的關鍵敏感基因，從而揭示這個過程的深層次機制，對于改善肝癌的治療和預后有著重要意義。
　　NEDD9的英文完整名稱是 Neural precursor cell Expressed Developmentally Down regulated9，在一些文獻里還被描述為HEF

4、1（Human enhancer of filamentation1），另外還有一種形式是 Cas-L，它的 mRNA包含2505nt。很多研究都已經把NEDD9基因定位于一個能夠決定腫瘤轉移的“開關”。在轉移性乳腺癌中，有一系列的異常表達基因可以作為特征性表現，而NEDD9正是其中一員。在高侵襲的膠質瘤中，NEDD9是前致癌基因 FAK激酶的特異性效應分子，對于腫瘤細胞的遷徙和侵襲至關重要，利用轉基因的手段下調NEDD9的表達水平能夠

5、削弱此種細胞的轉移能力。通過飽和性比較基因雜交的方法，在轉移性黑色素瘤的大基因組學研究中發(fā)現，NEDD9在一個小鼠轉移性黑色素瘤動物模型中是一個擴增子的目標基因，而這個擴增子與腫瘤的轉移關系密切。相似的研究證實在轉移性黑色素瘤中，NEDD9無論是在mRNA還是蛋白水平其表達量均明顯升高，即便是在沒有基因擴增的情況下依然如此，而且這種表達量的升高與腫瘤轉移過程密切相關?？偟脕碚f，NEDD9在細胞的轉移、生長和致癌性轉化中發(fā)揮著十分重要的作

6、用。然而 NEDD9也可能在不同腫瘤細胞的生物學過程中發(fā)揮著不同的作用，典型的例子就是在一個發(fā)生肺轉移的乳腺癌細胞系中 NEDD9的表達低于正常水平，這個研究被報道在《自然》雜志。雖然NEDD9在腫瘤侵襲轉移中的作用是一個近期的研究熱點，但NEDD9在肝癌侵襲轉移過程中的作用及其調控的相關分子網絡尚未見文獻報道。
　　目的：檢測 NEDD9在肝癌組織中及癌旁非腫瘤肝臟組織中的表達差異，探討NEDD9的表達與肝細胞癌一系列臨床指標及

7、預后的關系；利用基因轉染、RNA干擾等技術從體內、外觀察上調和下調NEDD9的表達水平對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲等細胞學特性的作用，評價其作為肝癌基因治療靶點的意義；探討NEDD9介導肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的可能機制。
　　方法：通過RT-qPCR和Western blot的方法檢測肝癌組織和癌旁非腫瘤組織中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表達；用免疫組織化學染色的手段研究肝癌組織中NEDD9的表達水平和常見臨床指標之間的關系；

8、NEDD9對肝癌復發(fā)和生存預后的意義通過采用生存分析的研究方法予以說明；通過基因重組的方法改變肝癌細胞中NEDD9的表達水平，并通過MTT、平板克隆形成實驗、劃痕修復實驗以及Transwell小室穿膜實驗分別分析NEDD9在體外對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。通過小鼠動物模型研究NEDD9在體內對肝癌細胞增殖、侵襲以及轉移能力的作用。末尾研究了NEDD9通過何種分子機制促進肝癌細胞增殖、遷移以及侵襲。
　　結果：
　　

9、1、第一部分實驗結果證明肝癌組織中NEDD9的mRNA及蛋白表達水平明顯高于相應的癌旁非腫瘤肝臟組織，此外NEDD9的表達量與腫瘤大小、腫瘤病理分化程度、有無其它臟器轉移、有無門靜脈侵犯以及腫瘤的TNM分期有關。生存分析顯示，NEDD9高表達的肝癌患者的術后無瘤生存時間以及總生存時間均明顯短于 NEDD9低表達的肝癌患者。NEDD9的表達水平可以作為一個獨立的肝癌預后指標，甚至包括一些臨床上難以判斷復發(fā)和預后的肝癌亞組。
　　2、

10、第二部分體外實驗發(fā)現，肝癌細胞系中NEDD9 mRNA表達水平均明顯高于正常肝臟細胞系，肝癌細胞系的NEDD9蛋白表達水平顯著高于正常肝臟細胞系。肝癌細胞相比較正常肝臟細胞表現出了較強的增殖、遷移及侵襲能力，這種增殖、遷移以及侵襲能力的差異與其 NEDD9 mRNA水平和蛋白水平的表達差異有著類似的趨勢。通過慢病毒轉染的方法穩(wěn)定轉染MHCC-97H以及Huh7細胞，分別上調和下調了兩種肝癌細胞中NEDD9的表達后發(fā)現，經過轉染上調NED

11、D9基因表達后的兩種肝癌細胞的增殖、運動遷移以及侵襲能力都明顯增強，而轉染下調NEDD9基因表達后的兩種肝癌細胞的增殖、運動遷移和侵襲能力明顯減弱。體內實驗中裸鼠皮下移植瘤成瘤實驗結果顯示，MHCC-97H肝癌細胞本身具有一定的成瘤能力，下調NEDD9表達后的 MHCC-97H細胞的裸鼠皮下移植瘤成瘤能力則明顯弱于對照組MHCC-97H細胞，腫瘤體積明顯較小。裸鼠肝癌肺轉移實驗發(fā)現表達正常水平NEDD9的MHCC-97H肝癌細胞有一定的

12、幾率形成肝癌肺轉移，下調NEDD9表達水平后的MHCC-97H肝癌細胞基本不會造成裸鼠肝癌肺轉移。
　　3、第三部分實驗結果證明NEDD9可能通過調控Fascin蛋白的表達及其結構的重組改變肝癌細胞骨架結構，從而促進了肝癌細胞的遷移和侵襲。上調肝癌細胞中NEDD9的表達后，轉錄因子 Snail、Slug的表達水平亦會隨之上調，而 E-cadherin的表達水平會隨之下調；下調NEDD9的表達后，轉錄因子Snail、Slug的表達水

13、平亦會隨之下調，而E-cadherin的表達水平會隨之上調。在肝癌細胞中上調NEDD9的表達后，金屬蛋白酶MMP-2以及 MMP-9的表達水平亦會隨之上調；下調 NEDD9的表達后，金屬蛋白酶MMP-2以及MMP-9的表達水平亦會隨之下調。
　　結論：NEDD9在肝癌組織中的表達水平明顯升高，NEDD9的表達水平與腫瘤大小、腫瘤病理分化程度、有無其它臟器轉移、有無門靜脈侵犯以及腫瘤的TNM分期有關。NEDD9可以預測肝癌的復發(fā)及生