NEDD9分子在肝癌細(xì)胞增殖遷移中的作用研究.pdf

1、研究背景:原發(fā)性肝癌是一種全球高發(fā)、惡性程度很高、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的惡性腫瘤。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成大部分肝癌患者死亡的原因。目前仍無(wú)特效的診斷與治療肝癌的手段。究其原因在于對(duì)肝癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足。與其它腫瘤相似，肝癌的發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制十分復(fù)雜，除了可能的外部因素外，內(nèi)部基因的表達(dá)與調(diào)控對(duì)其發(fā)生起著決定性作用。除了基因本身的突變，一系列調(diào)控因素諸如表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)也能影響到目的基因的表達(dá)。NEDD9是一個(gè)與發(fā)育相關(guān)的基因，在細(xì)胞的增殖與

2、發(fā)育中起著重要作用。但是具體作用機(jī)制目前不明，尤其是在原發(fā)性肝癌中的作用亟需研究。
　　研究目的:在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞中利用過(guò)表達(dá)NEDD9、合成shRNA抑制NEDD9的表達(dá)，使之形成NEDD9的過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的表型，觀察轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞體外遷移和增殖能力的變化。利用E.coli表達(dá)NEDD9與GST的融合表達(dá)蛋白，以體外的pull-down試驗(yàn)，獲取與NEDD9相互作用的蛋白，以質(zhì)譜鑒定。

3、
　　研究方法:1.提取肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞總RNA，利用RT-PCR的方法檢測(cè)NEDD9的mRNA表達(dá)。
　　2.利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NEDD9及幾段功能結(jié)構(gòu)域（N甲、N乙）在原核細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，期望純化蛋白做深入研究。
　　3.構(gòu)建NEDD9的真核表達(dá)質(zhì)粒，并基于軟件選擇NEDD9的干擾位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成shRNA，分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞體外遷移和增殖能力的改變。<

4、br>　　4.利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的NEDD9過(guò)表達(dá)和低表達(dá)肝癌細(xì)胞體外遷移能力的改變。
　　5.通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的NEDD9過(guò)表達(dá)和低表達(dá)肝癌細(xì)胞增殖能力的改變。
　　6.通過(guò)MTS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的NEDD9過(guò)表達(dá)和低表達(dá)肝癌細(xì)胞凋亡的改變。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.利用RT-PCR的方法檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中NEDD9的表達(dá)，結(jié)果顯示NEDD9在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)。
　　2.成功構(gòu)建了NEDD9在pc

5、DNA3.1中的過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞，利用RT-PCR的方法檢測(cè)到NEDD9在SMMC-7721細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。
　　3.將合成的shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞，利用RT-PCR的方法檢測(cè)其在mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)其能明顯降低肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)。
　　4.在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞中，抑制NEDD9的表達(dá)，可抑制細(xì)胞的體外遷移能力。合成的shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，

6、檢測(cè)到細(xì)胞的遷移能力降低。
　　5.抑制肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中NEDD9的表達(dá)可以減緩肝癌細(xì)胞的增殖。同上，過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后，首先鑒定NEDD9的表達(dá)水平升高程度，然后利用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。
　　6.確定NEDD9的表達(dá)水平抑制后，利用MTS試驗(yàn)檢測(cè)到細(xì)胞的凋亡增強(qiáng)。
　　結(jié)論:本研究提示NEDD9在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)，抑制NEDD9的表達(dá)可降低SMMC-7721細(xì)胞的