1、NEDD9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究;2、肝癌單鏈抗體的可溶性表達及活性鑒定.pdf

1、一、NEDD9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　肝癌是我國常見的一種惡性腫瘤，其惡性程度高，容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。大部分肝癌患者都是死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，然而對于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移目前治療手段有限。這就迫使科研工作者和臨床醫(yī)師不斷努力尋找肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因改變，以期闡明肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機制，試圖從根本上攻克肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　研究目的：檢測肝癌標本及肝癌細胞系中NEDD9的表達情況，分析其表達與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，利用RNA干擾

2、技術(shù)下調(diào)肝癌細胞系中NEDD9的表達，降低NEDD9的表達后觀察肝癌細胞體外遷移、侵襲能力及增殖能力的變化。
　　研究方法：
　　1、收集有及無轉(zhuǎn)移發(fā)生的肝癌標本，利用免疫組織化學(xué)的方法檢測肝癌標本中NEDD9的表達。
　　2、提取細胞總RNA利用RT-PCR的方法檢測肝癌細胞系及永生化的正常肝細胞中NEDD9的表達情況。
　　3、選擇干擾靶點，設(shè)計合成寡核苷酸鏈，體外退火后將其克隆入干擾表達載體pSilence

3、r3.1中，構(gòu)建針對NEDD9特異性的shRNA表達載體，利用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染肝癌細胞系MHCC97，通過RT-PCR、Western-blot及間接免疫熒光分別檢測NEDD9在mRNA水平和蛋白水平的變化。
　　4、下調(diào)肝癌細胞系中NEDD9的表達后，利用劃痕實驗及體外侵襲實驗檢測肝癌細胞體外遷移能力和侵襲能力的變化。
　　5、通過MTT檢測下調(diào)NEDD9的表達對肝癌細胞增殖能力的影響。
　　6、利用流式細胞儀檢測下調(diào)

4、NEDD9的表達對肝癌細胞周期的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NEDD9在大部分肝癌組織中均有表達，在有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中NEDD9的表達量及陽性率均較無轉(zhuǎn)移的肝癌組織高。
　　2、NEDD9在肝癌細胞系中表達增高。我們利用RT-PCR的方法檢測了三種肝癌細胞系MHCC97、HepG2、Huh7及永生化的正常肝細胞QZG中NEDD9的表達，結(jié)果顯示與正常肝細胞相比，三種肝癌細胞系中均有NEDD9的高

5、表達，高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系MHCC97中表達量較高。
　　3、成功構(gòu)建了針對NEDD9的shRNA表達載體。將所構(gòu)建的shRNA表達載體轉(zhuǎn)染肝癌細胞系MHCC97，發(fā)現(xiàn)其能明顯降低肝癌細胞中NEDD9的表達，無論是在mRNA水平還是在蛋白水平。
　　4、減低肝癌細胞系MHCC97中NEDD9的表達可以抑制肝癌細胞體外遷移和侵襲的能力。針對NEDD9的shRNA轉(zhuǎn)染會導(dǎo)致MHCC97細胞體外遷移能力的降低及侵襲能力下降。
　

6、　5、降低肝癌細胞系MHCC97中NEDD9的表達可以抑制肝癌細胞的增殖及出現(xiàn)細胞周期的S期阻滯。MHCC97細胞轉(zhuǎn)染NEDD9特異性的shRNA后，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的增殖能力受到了明顯的抑制；利用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)處于細胞周期S期的細胞數(shù)減少，出現(xiàn)了S期阻滯。
　　結(jié)論：本研究提示NEDD9在有轉(zhuǎn)移的肝癌標本中及高轉(zhuǎn)移的肝癌細胞系中高表達，通過體外實驗表明其在肝癌的遷移和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，是一個與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相

7、關(guān)的分子，有望成為一個抗肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的治療靶點或肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標。
　　二、肝癌單鏈抗體的可溶性表達及活性鑒定
　　腫瘤特異性單鏈抗體在腫瘤的診斷和治療中有著良好的應(yīng)用前景。我們實驗室利用噬菌體抗體庫技術(shù)，構(gòu)建了全人源肝癌單鏈抗體噬菌體庫，從中篩選到了一株肝癌特異性單鏈抗體，并在體外進行了原核表達，但是表達出的單鏈抗體主要是以包涵體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性過程才能夠得到有活性的目的蛋白。
　　實驗?zāi)康模簶?gòu)建

8、肝癌單鏈抗體的可溶性原核表達系統(tǒng)，并鑒定其生物學(xué)活性，為其下一步應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。
　　實驗方法：將所篩選出來的單鏈抗體基因克隆入原核表達載體pET-32a中，利用pET-32a表達出來的硫氧環(huán)蛋白增加目的蛋白的可溶性。將所構(gòu)建的重組載體克隆入大腸桿菌BL21表達菌中。利用IPTG誘導(dǎo)表達，表達后通過SDS-PAGE分析目的蛋白表達情況。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA純化后，利用細胞ELISA和間接免疫熒光等分析其活性。
　　實驗結(jié)

9、果：經(jīng)酶切鑒定，證實目的基因scFv-D25正確克隆入pET-32a中，成功構(gòu)建了原核表達載體pET-32a/scFv-D25。在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了scFv-D25的可溶性表達。經(jīng)Ni-NTA純化后得到了高純度的純化產(chǎn)物。通過細胞ELISA及間接免疫熒光分析證實所得的scFv-D25具有與肝癌結(jié)合的特異性。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了肝癌單鏈抗體的pET-32a表達載體，并在大腸桿菌中進行了表達，表達產(chǎn)物主要以可溶性形式存在。經(jīng)N