胚胎心臟祖細(xì)胞的生物學(xué)特性及向起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、1.研究目的和背景: 種子細(xì)胞是組織工程化組織、器官構(gòu)建,干細(xì)胞移植的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。心血管領(lǐng)域目前研究應(yīng)用的種子細(xì)胞,以胚胎干細(xì)胞(ESC)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)為主,但前者誘導(dǎo)分化條件復(fù)雜、易于成瘤,后者屬于成體干細(xì)胞的范疇,壽命有限、活力較差；且作為自體來源的細(xì)胞,BMSC必須在發(fā)現(xiàn)病例后才可進(jìn)行繁瑣的體外細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增,其時(shí)效性和有限的生長潛能限制了臨床的廣泛應(yīng)用。此外,已有的研究均表明上述兩種細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心血

2、管細(xì)胞的比率較低,因此,都不是理想的種子細(xì)胞。尋找適宜的種子細(xì)胞是開展心血管組織工程、和干細(xì)胞移植治療心血管疾患必須解決的首要問題。 從理論上推測,胚胎心臟干/祖細(xì)胞發(fā)育時(shí)序上更接近心臟的組織細(xì)胞,且具有較強(qiáng)的分化增殖能力,因而,誘導(dǎo)分化為心臟的組織細(xì)胞更容易。近來研究較多的心臟干/祖細(xì)胞主要有三種來源,分別是早期胚胎心臟或心管、成體心臟、ESC所形成類胚體中的心臟原基。后兩者來源的心臟干/祖細(xì)胞其分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究已有

3、較多報(bào)道,而從早期胚胎心管分離培養(yǎng)的心臟干/祖細(xì)胞生物學(xué)特性的研究目前則尚未見報(bào)道。從心臟發(fā)育的角度粗略講,早期胚胎心管中存在心肌源性祖細(xì)胞和心內(nèi)膜源性的祖細(xì)胞,前者構(gòu)成了心臟的絕大部分,最終形成各種類型的心肌細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞；后者在心臟中只占很小一部分,最終分化形成心內(nèi)膜、瓣膜、隔膜等組織。本課題擬對胚胎心臟祖細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究,以便為心臟組織工程、細(xì)胞移植治療心肌梗死、生物心臟起搏器的構(gòu)建等研究尋找一種理想的新型種子細(xì)胞。

4、 2.材料和方法: 2.1人胚胎心臟祖細(xì)胞的生物學(xué)特性 2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 2.1.1.1胚胎心臟祖細(xì)胞的培養(yǎng)取4周胚齡的藥物流產(chǎn)人胚胎,在解剖顯微鏡下分離心管,將心管在0.25％胰酶中消化分散為單細(xì)胞懸液；上述得到的單細(xì)胞懸液離心并去上清,使用含15％胎牛血清、0.375％碳酸氫鈉、10ug/L VEGF、106U/L LIF、106U/L青霉素、106U/L鏈霉素、2mmol/L谷安酰氨的高糖DM

5、EM培養(yǎng)液重懸；將重懸的單細(xì)胞懸液接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代擴(kuò)增。 2.1.1.2胚胎心臟祖細(xì)胞的鑒定人胚胎心臟祖細(xì)胞的鑒定包括：①形態(tài)學(xué)的觀察；②采用免疫熒光的方法檢測Nkx2.5、Is1-1分子標(biāo)志物的表達(dá)：③采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測平滑肌肌動蛋白、細(xì)胞角蛋白、VⅢ因子,C-kit的表達(dá)；④RT-PCR檢測GATA-4(心臟特異轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)。 2.1.2胚胎心臟祖細(xì)胞的生物學(xué)特

6、性 2.1.2.1胚胎心臟祖細(xì)胞的基本生物學(xué)特性通過倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；通過生長曲線和分裂指數(shù)曲線的繪制檢測細(xì)胞的生長特性。 2.1.2.2胚胎心臟祖細(xì)胞的分化特性 2.1.2.2.1向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化利用5-氮胞苷誘導(dǎo)第15代胚胎心臟祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化,分別在誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后10天、15天三個時(shí)相RT-PCR檢測心肌源性特異基因GATA-4、α-MHC的表達(dá),免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的

7、方法檢測心肌肌動蛋白的表達(dá),倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,Western Blot的方法檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞心肌肌動蛋白的表達(dá)。 2.1.2.2.2向平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與家犬血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎心臟祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞方向分化,對誘導(dǎo)前后的細(xì)胞免疫熒光檢測α-SMA和MHC-sm的表達(dá),Westem Blot的方法檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞α-SMA的表達(dá)。 2.2胚胎心臟祖細(xì)胞向心臟起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 2.2.1

8、大鼠胚胎心臟祖細(xì)胞的培養(yǎng)250g雌雄SD大鼠配對合籠喂養(yǎng),第二天觀察糞盤是否有陰栓,確定雌鼠受孕開始時(shí)間；于受孕后10.5天斷頸處死母鼠,取出子宮在無菌PBS中洗滌,用鑷子撕開子宮和羊膜,分離得到心管；將心管在0.25％胰酶中消化分散為單細(xì)胞懸液后,采用與人胚胎心臟祖細(xì)胞相同的操作接種、培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增大鼠胚胎心臟祖細(xì)胞。 2.2.2大鼠胚胎心臟祖細(xì)胞的鑒定大鼠胚胎心臟祖細(xì)胞的鑒定包括：①形態(tài)學(xué)的觀察鑒定；②采用免疫熒光的方法檢測

9、原代、第5代、第20代細(xì)胞Nkx2.5分子標(biāo)志物的表達(dá)；③采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細(xì)胞OCT-4分子標(biāo)志物的表達(dá)；④采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細(xì)胞階段特異性胚胎抗原SSEA-4分子的表達(dá)。 2.2.3大鼠胚胎心臟祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化胚胎心臟祖細(xì)胞接種培養(yǎng)兩天后,更換培養(yǎng)基為含有內(nèi)皮素-1的DMEM,送孵箱進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),三天后換回正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的搏動情況并錄

10、像。誘導(dǎo)前后的細(xì)胞通過免疫熒光的方法檢測HCN2、HCN4、Connexin43、Connexin45、心肌肌動蛋白、Nkx2.5、OCT-4的表達(dá),通過HE染色和電鏡觀察檢測其形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,通過膜片鉗技術(shù)檢測其電生理情況。 3.結(jié)果: 在本研究中,胚胎心臟祖細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)五天后,光鏡下直接觀察或HE染色觀察其基本形狀與誘導(dǎo)前相比無明顯改變；但透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)證實(shí)誘導(dǎo)后細(xì)胞有了較為明顯的分化；證據(jù)之一是誘導(dǎo)后

11、出現(xiàn)較誘導(dǎo)前為多的簡單細(xì)胞器結(jié)構(gòu),包括少量的線粒體、尚不發(fā)達(dá)的高爾基體和較不完整的肌絲樣結(jié)構(gòu),證據(jù)之二是誘導(dǎo)后細(xì)胞之間可見有連接樣的結(jié)構(gòu)增多。這一超微結(jié)構(gòu)上的變化在免疫熒光染色上得到了進(jìn)一步的證實(shí),心肌肌動蛋白(細(xì)肌絲的主要組成成分)的染色在誘導(dǎo)前后由陰性變?yōu)榱岁栃?縫隙連接蛋白43和45在誘導(dǎo)后也出現(xiàn)了多量的表達(dá)。肌動蛋白的表達(dá)或肌絲樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)是誘導(dǎo)后細(xì)胞搏動更為明顯的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而縫隙連接蛋白的表達(dá)則表明誘導(dǎo)后細(xì)胞之間更易建立肌電偶

12、聯(lián)。總之,搏動情況和形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化為誘導(dǎo)后細(xì)胞已經(jīng)向起搏細(xì)胞方向發(fā)生轉(zhuǎn)變給出了初步的證據(jù)。 起搏細(xì)胞之所以具有自動興奮性,是由于在動作電位四期激活產(chǎn)生一種稱為If的內(nèi)向離子流,導(dǎo)致了細(xì)胞的自動除極。編碼If離子流的通道分子稱為超級化激活的環(huán)核苷酸門控的離子通道(hyperpolarization-activated cyclicnucleotide-gated channel,HCN),由于HCN與心臟起搏的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)關(guān)系密切

13、,所以被稱為起搏基因。在本研究中,我們通過免疫熒光染色和RT-PCR檢測了誘導(dǎo)后細(xì)胞起搏基因HCN2和HCN4的表達(dá),結(jié)果證明了誘導(dǎo)后細(xì)胞存在上述兩種起搏離子通道,具備了起搏細(xì)胞產(chǎn)生自動興奮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進(jìn)一步我們利用單細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測誘導(dǎo)后胚胎心臟祖細(xì)胞的電生理情況,顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞出現(xiàn)了連續(xù)的自發(fā)性動作電位(竇房結(jié)樣起搏動作電位和心房肌樣起搏動作電位),這一結(jié)果最終證明了誘導(dǎo)后細(xì)胞可以自發(fā)產(chǎn)生起搏動作電位(自動興奮性),具備了起搏細(xì)胞