人外泌汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特性及其iPS細(xì)胞向汗腺分化的研究.pdf

1、大面積皮膚嚴(yán)重?zé)齻木戎问悄壳柏酱鉀Q的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。全國(guó)每年近千萬(wàn)人的燒傷病人，近萬(wàn)人嚴(yán)重?zé)齻?，其中約10％的嚴(yán)重?zé)齻∪擞捎谌狈ζぴ瓷袩o(wú)法挽救其性命。嚴(yán)重?zé)齻@救的病人由于無(wú)汗腺功能的疤痕組織取代皮膚使其終生喪失正常皮膚功能，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。
　　汗腺是人體皮膚組織中重要的功能性附屬器，汗腺可分為頂泌汗腺即大汗腺，和外泌汗腺即小汗腺。一般所說(shuō)的汗腺是外泌汗腺，在調(diào)節(jié)體溫、分泌汗液及排出人體部分代謝廢物的過(guò)程中發(fā)揮重要

2、的作用。外泌汗腺是單管狀腺，分為分泌部和導(dǎo)管部，分泌部位于真皮層或皮下組織內(nèi)，是盤(pán)曲成團(tuán)的小管，而導(dǎo)管部開(kāi)口于表皮層，連接分泌部和外界環(huán)境。汗腺的發(fā)育開(kāi)始于胚胎時(shí)期14-16周，至24周基本成熟，出生之后不會(huì)有新生的汗腺組織形成。
　　皮膚組織修復(fù)和功能重建在國(guó)內(nèi)和國(guó)際上都是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的核心和熱點(diǎn)。輕度燒傷時(shí)，汗腺的導(dǎo)管處細(xì)胞可以其深部未受損的部分為模版從而重建汗腺被損壞的部分；但全層皮膚大面積深度燒傷時(shí)，由于汗腺組織被毀，

3、則不能依賴細(xì)胞的分裂、增殖與終末分化來(lái)自我更新而重建其復(fù)雜結(jié)構(gòu)。至今尚無(wú)有效的方法體外擴(kuò)增人汗腺細(xì)胞，對(duì)其生物學(xué)特性知之甚少。同時(shí)，干細(xì)胞可以定向分化為并構(gòu)建具有覆蓋保護(hù)能力的表皮層組織；也有研究表明干細(xì)胞可以定向分化為具有汗腺細(xì)胞表型的汗腺樣細(xì)胞，但是對(duì)于汗腺組織的功能性重建還未見(jiàn)報(bào)道，且干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞的具體機(jī)制尚待探討。
　　本研究皆在建立人外泌汗腺細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)方法，并分析其生物學(xué)特性，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建人汗腺

4、細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞，根據(jù)iPS細(xì)胞具有來(lái)源細(xì)胞的記憶性這一特性，開(kāi)展汗腺細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞的研究，探討其分化的關(guān)鍵分子機(jī)制，為其他類型干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞提供理論基礎(chǔ)，使汗腺的功能性重建和功能性皮膚修復(fù)成為可能，提高大面積燒傷病人救治后的臨床療效，具有研究的創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　第一部分人外泌汗腺細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的鑒定。
　　目的：
　　建立體外分離、提取、培養(yǎng)和純化人外泌

5、汗腺細(xì)胞的方法，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　將人皮膚樣本除去脂肪和結(jié)締組織，剪成1mm2的小塊，用分散酶于4℃消化18小時(shí)，第二天取出后用PBS漂洗。用鑷子將真皮層與表皮層輕輕分離，真皮層用剪刀剪碎，加入IV型膠原酶于37℃消化1小時(shí)，然后在倒置顯微鏡下使用移液槍將游離的汗腺組織吸出。在6cm的培養(yǎng)皿中先預(yù)先鋪一層鼠尾膠原，將汗腺貼于預(yù)鋪了膠原的6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，一個(gè)小時(shí)后加入汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、5%

6、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3d后，汗腺細(xì)胞從汗腺組織中長(zhǎng)出。倒置顯微鏡觀察人外泌汗腺細(xì)胞形態(tài)；免疫組化方法對(duì)比不同部位來(lái)源皮膚汗腺數(shù)量的多少；透射電鏡觀察皮膚樣本汗腺細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)；PCR分析汗腺細(xì)胞胚胎干細(xì)胞標(biāo)記和角質(zhì)化細(xì)胞標(biāo)記；免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞的標(biāo)志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（1）光學(xué)倒置顯微鏡下觀察人外泌汗腺，游離出來(lái)的汗腺組織可以觀察到盤(pán)曲成球的分泌

7、部和較直的導(dǎo)管部；貼壁培養(yǎng)后可見(jiàn)汗腺上皮細(xì)胞從汗腺組織中生長(zhǎng)出來(lái)，呈典型的上皮細(xì)胞樣，排列緊密，類似鋪石路狀，細(xì)胞邊界明顯，核清晰，具有一定的增殖能力；
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示，成人手掌部、成人頭頸部和成人胸腹部的皮膚處存在的汗腺數(shù)量較少，而手術(shù)切除的嬰幼兒多指樣本皮膚中存在有大量的汗腺；
　　（3）透射電鏡結(jié)果顯示，皮膚中汗腺導(dǎo)管處由兩層細(xì)胞構(gòu)成，且存在有張力原纖維，汗腺腺體分泌部由兩類細(xì)胞構(gòu)成，分別是構(gòu)成管腔的細(xì)胞和

8、肌上皮細(xì)胞；
　?。?）PCR結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞，不表達(dá)胚胎干細(xì)胞的干性指標(biāo)Oct-4、Sox-2和Nanog，表達(dá)增殖相關(guān)基因Klf-4和c-Myc，表達(dá)汗腺特異性指標(biāo)CEA，表達(dá)上皮細(xì)胞指標(biāo)K14、K8、K18和K19；
　?。?）免疫熒光染色結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)的人汗腺細(xì)胞表達(dá)汗腺特異性指標(biāo)C EA，表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記K14、K8和K18。
　　結(jié)論：
　　成功從手術(shù)切除的嬰幼兒皮膚樣本中分離提取

9、出大量的汗腺組織，滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要；體外分離培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞具有一定的增殖能力，能傳代培養(yǎng)2~3代；對(duì)體外培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，表達(dá)汗腺特異性指標(biāo)CEA，表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記K14、K8和K18,具有上皮細(xì)胞的特性，為進(jìn)一步研究汗腺細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分人外泌汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞的構(gòu)建以及定向分化為汗腺樣細(xì)胞的研究
　　目的：
　　構(gòu)建人外泌汗腺細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定；定向誘導(dǎo)人

10、外泌汗腺細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性及功能性進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　取體外培養(yǎng)10天后的汗腺細(xì)胞，以1×105個(gè)/皿的密度接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入4種含有胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒，24小時(shí)后移除含有慢病毒的培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入新鮮的汗腺細(xì)胞完全培養(yǎng)基；2-3天后，消化細(xì)胞接種到鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，更換胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)

11、約10天后，挑選克隆和細(xì)胞形態(tài)與胚胎干細(xì)胞相似的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板中。培養(yǎng)約10天后，再次挑選克隆和細(xì)胞形態(tài)與胚胎干細(xì)胞相似的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；RT-PCR，免疫熒光染色檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞生物學(xué)特性；細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)計(jì)數(shù)分析汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞的增殖能力；體外培養(yǎng)的人汗腺細(xì)胞經(jīng)過(guò)5-7天的培養(yǎng)，更換培養(yǎng)基為KGM2培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)過(guò)人汗腺細(xì)胞的KGM2培養(yǎng)基，用0.22μ

12、m的濾器過(guò)濾，收集到的培養(yǎng)基為CM；取穩(wěn)定培養(yǎng)的人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，24小時(shí)后，待iPS細(xì)胞貼壁后，添加汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SGDM，汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基：CM=1:1，額外添加50ng/ml EGF）；然后每天更換培養(yǎng)汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率為70%，對(duì)細(xì)胞消化傳代，按1傳4的比例接種細(xì)胞至新的培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化21天后得到汗腺樣細(xì)胞；光學(xué)顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)； Realt

13、ime-PCR分析其基因表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)汗腺相關(guān)蛋白表達(dá)；免疫熒光染色檢測(cè)汗腺相關(guān)蛋白表達(dá)；電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)；3D組織培養(yǎng)方法檢測(cè)分化后的汗腺樣細(xì)胞形成汗腺樣結(jié)構(gòu)的能力，并對(duì)形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　?。?）光學(xué)顯微鏡下觀察構(gòu)建的人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞，呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界明顯，核質(zhì)比較高，有形成類胚體的能力，與人胚胎干細(xì)胞相似；
　?。?）PCR結(jié)果表明人汗腺細(xì)胞來(lái)源i

14、PS細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞指標(biāo)Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanong，同時(shí)也表達(dá)汗腺相關(guān)指標(biāo)K14和CD24；
　?。?）免疫熒光染色結(jié)果顯示人汗腺細(xì)胞來(lái)源 iPS細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81；
　?。?）細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果表明人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞具有良好的增殖能力；
　?。?）光學(xué)顯微鏡下觀察，由汗腺細(xì)胞來(lái)源

15、iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的汗腺樣細(xì)胞，細(xì)胞變大，成上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)，核質(zhì)比變??；而人汗腺細(xì)胞，細(xì)胞較大，具有明顯的上皮細(xì)胞形態(tài)，呈鋪路石狀生長(zhǎng)，細(xì)胞排列整齊。
　?。?）Realtime-PCR結(jié)果顯示，汗腺細(xì)胞來(lái)源 iPS細(xì)胞在誘導(dǎo)的過(guò)程中，在mRNA水平上逐漸表達(dá)汗腺細(xì)胞指標(biāo) EDA、EDAR、K8和CEA，且在分化的過(guò)程中逐漸接近汗腺細(xì)胞。
　?。?）流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)汗腺相關(guān)指標(biāo)EDA大約63%

16、，EDAR大約65%，K8大約76%，CEA大約56%。
　　（8）透射電鏡結(jié)果表明，誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞具有人汗腺細(xì)胞有的微絨毛，而汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞則沒(méi)有微絨毛；
　　（9）3D組織培養(yǎng)結(jié)果顯示，汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞能夠在膠中形成汗腺管狀結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔，可觀察到誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成管腔的過(guò)程，汗腺樣細(xì)胞在膠中增殖成團(tuán)，中間的細(xì)胞逐漸凋亡，形成管腔；
　?。?0）

17、免疫熒光染色的結(jié)果表明，汗腺細(xì)胞來(lái)源 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)表達(dá)部分汗腺相關(guān)基因。
　　結(jié)論：
　　利用iPS技術(shù)成功構(gòu)建人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測(cè)分析，與人胚胎干細(xì)胞相似；定向誘導(dǎo)人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡、Realtime-PCR、免疫熒光染色、透射電鏡及3D組織培養(yǎng)結(jié)果顯示，人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞能分化為汗腺樣細(xì)胞，并且具有形成汗腺樣結(jié)

18、構(gòu)的能力。
　　第三部分干細(xì)胞汗腺分化機(jī)制的探討
　　目的：
　　在建立使用條件培養(yǎng)基（Condition media，CM）可誘導(dǎo)人汗腺來(lái)源iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞的基礎(chǔ)上，分析CM中可能起關(guān)鍵作用的分子，為干細(xì)胞汗腺分化尋找合適的培養(yǎng)體系，為研究干細(xì)胞汗腺分化機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　取2×104的人汗腺來(lái)源iPS細(xì)胞（SG-iPS）鋪于6孔板一孔中，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SGDM，汗腺細(xì)胞

19、培養(yǎng)基：CM=1:1，額外添加50ng/ml EGF），分別取誘導(dǎo)7天，14天和21天的樣本，利用Realtime-PCR方法檢測(cè)分析不同分化時(shí)間點(diǎn)的汗腺樣細(xì)胞的基因表達(dá)情況；針對(duì)BMP4和HGF信號(hào)通路，利用Realtime-PCR方法和免疫熒光染色的方法分析在分化過(guò)程中BMP4和HGF可能的來(lái)源，比較人汗腺細(xì)胞（SG）、人汗腺細(xì)胞培養(yǎng)中存在的成纖維細(xì)胞（SG-Fib）以及SG-Fib脫離SG環(huán)境培養(yǎng)2周的成纖維細(xì)胞（Fib）；Wes

20、tern blot和ELISA檢測(cè)CM中HGF和BMP4的存在；在SG-iPS分化到汗腺樣細(xì)胞的過(guò)程中，加入HGF和BMP4拮抗劑，分化21天后Realtime-PCR方法檢測(cè)汗腺相關(guān)基因的表達(dá)；在SG-iPS分化到汗腺樣細(xì)胞的過(guò)程中額外添加HGF和BMP4，分化21天后Realtime-PCR方法檢測(cè)汗腺相關(guān)基因的表達(dá)；
　　結(jié)果：
　?。?）Realtime-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR和LEF1

21、的表達(dá)在分化過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，在第14天達(dá)到峰值，分化21天后表達(dá)水平接近正常汗腺細(xì)胞，說(shuō)明EDA，EDAR和Left1在汗腺分化過(guò)程中發(fā)揮一定作用；進(jìn)一步檢測(cè)其上游基因表達(dá)，包括MAPK通路和Wnt通路中相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)ERK和β-catenin的表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性。BMP4，HGF，F(xiàn)GF10是胞外與MAPK和Wnt通路有相關(guān)作用的分子，檢測(cè)其受體在細(xì)胞膜上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BMP4受體BMPR1和BMPR2及HGF受體HGFR在分化過(guò)程中均有

22、表達(dá)，而 FGF10受體FGFR2則沒(méi)有表達(dá)；Realtime-PCR方法檢測(cè)BMP4和HGF在分化過(guò)程中的來(lái)源結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中，BMP4主要由汗腺細(xì)胞來(lái)源的成纖維細(xì)胞分泌，汗腺細(xì)胞也有不同程度的分泌，而H GF則主要由汗腺來(lái)源的成纖維細(xì)胞分泌，免疫熒光染色的結(jié)果也證明了這一結(jié)果；在汗腺來(lái)源CM中，Western blot和ELISA結(jié)果顯示HGF和BMP4均有存在，這說(shuō)明在CM中存在對(duì)汗腺分化具有作用的HGF和BMP4；
　　

23、（2）在分化過(guò)程中加入BMP4和HGF拮抗劑后，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR、CEA和K8均有不同程度的下降，加入HGF拮抗劑的基因表達(dá)下降的比加入BMP4拮抗劑的明顯；在分化過(guò)程中額外加入BMP4和HGF重組蛋白取代CM中可能存在的未知分子，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR、CEA和K8表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，但還不如汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的效果明顯。
　　結(jié)論：
　　由人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞的過(guò)程中，從CM中尋找到

24、兩個(gè)相關(guān)因子，HGF和BMP4在人汗腺來(lái)源iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，得出兩條可能的汗腺分化的作用途徑：HGF和BMP4通路。HGF與細(xì)胞膜上的受體c-Met結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)中β-cate nin表達(dá)上升，β-cate nin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與Lef1作用，激活EDA/EDAR信號(hào)通路，從而啟動(dòng)汗腺分化；BMP4與細(xì)胞膜上的受體BMPR1和BMPR2結(jié)合，激活MAPK通路中的其中一條ERK通路，隨后ERK與細(xì)胞核中的Lef1作

25、用激活EDA/EDAR信號(hào)通路，從而啟動(dòng)汗腺分化。
　　綜上所述，本課題成功分離提取了人外泌汗腺，建立了體外培養(yǎng)人外泌汗腺細(xì)胞的方法，并用體外培養(yǎng)的人外泌汗腺細(xì)胞成功構(gòu)建的人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上定向誘導(dǎo)人汗腺細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞，對(duì)得到的汗腺樣細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)特性及功能性鑒定，在誘導(dǎo)分化的過(guò)程中尋找到了兩個(gè)可能的關(guān)鍵分子HGF和BMP4，建立了合適的干細(xì)胞汗腺分化培養(yǎng)體系，不