禽呼腸孤病毒M1、M2基因克隆序列分析與病毒受體的確定及熒光定量RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、禽呼腸孤病毒(ARV)主要感染雞和火雞，在雞群中普遍存在，常與其他疾病混合感染，臨床上表現(xiàn)多種病癥，導(dǎo)致雞的生長能力下降及死亡率升高。為了更有效的預(yù)防和控制ARV，降低ARV對養(yǎng)禽業(yè)的危害，本課題開展了ARV M1、M2基因的克隆與序列分析及病毒受體的初步研究，并應(yīng)用SYBR Green Ⅰ染料建立了ARV的熒光定量RT-PCR檢測方法。 根據(jù)GenBank ARV M1、M2基因序列，設(shè)計兩對引物，分別對9株ARV的M1、M2

2、基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增、克隆及序列測定。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的克隆質(zhì)粒中含相應(yīng)的M1、M2蛋白基因完整ORF，大小分別為2199bp和2031bp，分別編碼732和676個氨基酸的μA和μB蛋白；經(jīng)分析，測序的9株ARV M1、M2基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列具有高度的同源性，M1基因在99.3％～99.7％和99.3％～99.7％之間，M2基因在98.7％～99.9％和97.8％～99.9％之間。與GenBank上其他呼腸孤病毒株包

3、括美國分離株(2408)、日本分離株(OS161)和4株臺灣分離株(1017-1、601G、750505、916SI)進(jìn)行比較，結(jié)果表明所有毒株M1基因的核苷酸和氨基酸同源性都較高，分別在88.3％～100％和97.0％～100％之間；M2基因與2408株和1017-1株的核苷酸和氨基酸同源性高，均在98％以上，而與其他分離株的核苷酸和氨基酸同源性較低，僅在69.5％～72.0％之間和85.5％～89.5％之間；遺傳進(jìn)化樹分析表明M2基

4、因中多數(shù)臺灣株和日本株變異大。 將培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞接種ARV S1133病毒株以增殖病毒，待細(xì)胞病變達(dá)60％-80％時收毒，凍融三次后通過差速離心和蔗糖密度梯度離心純化病毒，經(jīng)紫外分光法測病毒蛋白濃度為6.25mg/mL。提純雞胚原代肝細(xì)胞膜蛋白測濃度為16mg/mL。取24uL濃度為16ug/uL的膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)即膜蛋白電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上依次與病毒、抗血清和酶

5、標(biāo)二抗作用顯出病毒受體結(jié)合帶的方法結(jié)合Bandscan分析病毒受體分子量為68.6kDa。 根據(jù)S1基因σC結(jié)構(gòu)蛋白基因保守區(qū)域設(shè)計一對擴(kuò)增片斷為147bp的特異性引物，將PCR擴(kuò)增的σC基因片段，連接pGM-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、PCR鑒定及測序進(jìn)一步證實，表明σC片段正確克隆入pGM-T載體中，命名為pGM-T-σC。提取質(zhì)粒用Sal I單酶切得到線性化轉(zhuǎn)錄模板DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA，以體外轉(zhuǎn)錄的RNA為標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲

6、線，應(yīng)用SYBR Green I染料建立了檢測禽呼腸孤病毒的一步法熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量濃度范圍寬，在5.2×102-5.2×109拷貝/uL之間呈良好的線性關(guān)系，可檢測到每個反應(yīng)相當(dāng)于5.2×102個拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品RNA；該方法特異性好，與NDV、IBDV、MG都不反應(yīng)。 本課題開展了ARV M1、M2基因的克隆與序列分析及甩VOPBA鑒定了ARV受體的分子量，為進(jìn)一步研究病毒各蛋白問的相互作用、