Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景與目的
　　 神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是小兒最常見的顱外惡性實(shí)體腫瘤，占小兒所有惡性腫瘤的10％，惡性程度高，多數(shù)患兒預(yù)后不良。盡管近年來手術(shù)結(jié)合化療的綜合療法在治療NB方面取得了很大的進(jìn)步，但是其發(fā)病率和死亡率仍然較高。因此，深入研究NB的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理至關(guān)重要。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種胚胎性腫瘤，胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育分化受阻是神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生的主要原因，亦是衡量神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度及影響預(yù)后的主要危

2、險(xiǎn)因素。Sox2是一種胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，是調(diào)控胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因子，在早期胚胎發(fā)育過程中對(duì)維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新的能力具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。故我們試圖探索Sox2基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。
　　 材料與方法
　　 1.Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)：采用RT-PCR、Real.time PCR、Western blot及

3、免疫組織化學(xué)等方法檢測Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料，分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 2.Sox2對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響：采用RT-PCR檢測Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-C細(xì)胞中的表達(dá)情況。利用慢病毒載體感染BE(2)-C細(xì)胞構(gòu)建Sox2高表達(dá)[BE(2)-C-Sox2]和低表達(dá)[BE(2)-C-shRNA]細(xì)胞，然后采用CCK-8活細(xì)胞數(shù)檢測和流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析

4、，探討Sox2對(duì)BE(2)-C細(xì)胞增殖能力的影響。維甲酸(RA)和5-溴2’-去氧尿甙(BrdU)干預(yù)細(xì)胞誘導(dǎo)分化后采用Western blot檢測細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)差異，分析Sox2對(duì)BE(2)-C細(xì)胞分化能力的影響。平板克隆和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù)目和克隆形成率，分析Sox2對(duì)BE(2)-C細(xì)胞克隆形成能力的影響。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)分析Sox2對(duì)BE(2)-C細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　 3.基因芯片檢測Sox2下

5、調(diào)時(shí)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞基因表達(dá)譜變化：應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片檢測BE(2)-C細(xì)胞和BE(2)-C-shRNA細(xì)胞基因表達(dá)譜情況，篩選差異基因，并采用Real-time PCR檢測驗(yàn)證相關(guān)差異表達(dá)的基因。
　　 結(jié)果
　　 1.Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中可檢測到Sox2基因mRNA水平表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示Sox2主要在腫瘤細(xì)胞核中表達(dá)，而瘤旁組織中表達(dá)呈陰性。Real-

6、time PCR及Western blot結(jié)果均顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中Sox2的表達(dá)水平明顯高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)Sox2在高分期腫瘤中的表達(dá)水平高于低分期腫瘤(P<0.05)，且未經(jīng)化療的腫瘤其Sox2的表達(dá)水平高于經(jīng)化療的腫瘤(P<0.05)。Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位、大小、病理分型等參數(shù)無相關(guān)性(均P>0.05)。
　　 2.Sox2對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)

7、胞生物學(xué)特性的影響：RT-PCR結(jié)果顯示在神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-C細(xì)胞系中可檢測到Sox2基因mRNA水平表達(dá)。利用慢病毒載體感染BE(2)-C細(xì)胞成功構(gòu)建Sox2高表達(dá)[BE(2)-C-Sox2]和低表達(dá)[BE(2)-C-shRNA]穩(wěn)定細(xì)胞。CCK-8活細(xì)胞數(shù)檢測顯示72h時(shí)BE(2)-C-Sox2細(xì)胞的AV值(1.465±0.046)高于BE(2)-C細(xì)胞(1.01±0.018)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而BE(2)-

8、C-shRNA細(xì)胞的AV值(0.912±0.020)低于BE(2)-C細(xì)胞(1.201±0.018)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示BE(2)-C-Sox2組S期細(xì)胞百分比(55.2±4.3％)高于BE(2)-C組細(xì)胞(38.6±3.5％)，BE(2)-C-shRNA組S期細(xì)胞百分比(21.8±5.7％)低于BE(2)-C組細(xì)胞，三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而三組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比

9、的比較情況呈現(xiàn)出相反的結(jié)果；BE(2)-C-Sox2、BE(2)-C及BE(2)-C-shRNA組的細(xì)胞增殖指數(shù)分別為65.2±5.6％、36.3±2.8％、51.7±4.6％，三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RA或BrdU干預(yù)后Western blot檢測細(xì)胞標(biāo)志蛋白(Peripherin、NF-68、Vimentin、S-100)顯示，經(jīng)RA或BrdU干預(yù)的BE(2)-C-Sox2細(xì)胞其標(biāo)志蛋白表達(dá)量低于經(jīng)同種藥物干預(yù)

10、的BE(2)-C細(xì)胞和空載體細(xì)胞(P<0.05)；而經(jīng)RA或BrdU干預(yù)的BE(2)-C-shRNA細(xì)胞其標(biāo)志蛋白表達(dá)量高于經(jīng)同種藥物干預(yù)的BE(2)-C細(xì)胞和空載體細(xì)胞(P<0.05)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示BE(2)-C-Sox2細(xì)胞的克隆形成數(shù)目(103±18)和克隆形成率(20.6％)均高于BE(2)-C細(xì)胞(75±12，15％)，而BE(2)-C-shRNA細(xì)胞的克隆形成數(shù)目(42±7)和克隆形成率(8.4％)均低于BE(2)-

11、C細(xì)胞，三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)未成功，細(xì)胞均死亡。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示BE(2)-C-Sox2接種組腫瘤的生長速度和體積均大于BE(2)-C接種組，而BE(2)-C-shRNA接種組腫瘤的生長速度和體積均低于BE(2)-C接種組，三組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.基因芯片檢測Sox2下調(diào)時(shí)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞基因表達(dá)譜變化：Sox2基因表達(dá)下調(diào)時(shí)基因表達(dá)譜芯片篩得差異表

12、達(dá)的基因有596條，其中差異顯著的基因有FMN1、GFRA2、HIST1H2BK、CARTPT、AHNAK2、PLP2、TSPAN8、TIMP2、EPO和PRR11等。經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證，證實(shí)芯片篩選的結(jié)果可靠。
　　 結(jié)論
　　 1.Sox2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤(組織和細(xì)胞)中存在表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期有一定相關(guān)性，與性別、年齡等參數(shù)無明顯相關(guān)性?；熕幬飳?duì)Sox2的表達(dá)有抑制作用。
　　 2