免疫負調控因子TIPE2與核蛋白PCNP雙向調節(jié)在白血病細胞中的生物學作用.pdf

1、背景：白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病,由于白細胞在分化、成熟的過程中受到某些因素的影響使其分化發(fā)育停止,以至于白細胞停留在不同的發(fā)育階段并無限制地的克隆。在骨髓和其他造血器官中,白血病細胞大量堆積并抑制正常造血細胞的功能。白血病人的免疫系統(tǒng)的功能受到嚴重的抑制,以至于病人發(fā)生發(fā)熱、出血、貧血,后期累及體內多種器官衰竭死亡。所以白血病人的免疫系統(tǒng)功能的恢復對白血病人的生存率和生活質量都有很大的幫助。TNFAIP8L2(tumor n

2、ecrosis factor-a-induced protein-8 like2)即TIPE2是最近發(fā)現(xiàn)的一個重要的免疫負調控因子,參與多種腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展。TIPE2在淋巴細胞白血病人的外周血中的表達量是升高的,TIPE2基因沉默后影響Jurkat細胞的生長,并影響JNK1和新型基因PCNP的表達,由此,本課題主要研究的是TIPE2對白血病Jurkat細胞的生物學功能的影響,以及TIPE2、PCNP、JNK1三者之間的關系,為更進

3、一步探討TIPE2是否調控白血病的發(fā)生奠定基礎。
　　目的：在白血病Jurkat細胞中將TIPE2基因過表達后,檢測其生物學功能的改變同時將PCNP和JNK1分別沉默和過表達后檢測對TIPE2的表達量的影響,和對Jurakt細胞生物學功能的影響。
　　方法：將TIPE2的CDS區(qū)重組到過表達質粒pcDNA3.1(-)中,并將重組質粒pcDNA3.1(-)-TIPE2電轉到白血病Jurkat細胞中,加藥進行篩選并篩出穩(wěn)定株。在

4、mRAN水平上用qPCR方法檢測TNFAIP8家族其他成員(TNFAIP8,TIPE1,TIPE3)的表達量。用臺盼藍染色人工計數(shù)的方法作出生長曲線圖,用流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡。用NBT檢測細胞的分化情況,用Transwell小室檢驗對細胞遷移的影響。用免疫印跡雜交(Western Blot)方法檢測TIPE2過表達后對基因PCNP(PEST-containing nuclear protein))、JNK1(c-Jun N-

5、terminal kinase1,JNK1)、Caspase3、Caspase8的表達量的影響,從而分析TIPE2在白血病中可能發(fā)揮的作用。在Jurkat細胞中利用基因沉默技術將PCNP沉默和利用基因抑制劑將JNK1基因沉默后觀察對TIPE2的影響,另一方面將PCNP和JNK1過表達后觀察對TIPE2的影響,同時檢測PCNP和JNK1對Jurkat細胞生物學功能的影響,進而弄清楚TIPE2、PCNP、JNK1三者之間的關系以及是怎樣影響

6、Jurkat細胞生物學功能的。
　　結果：成功構建TIPE2基因過表達重組質粒并穩(wěn)定轉染到Jurkat細胞中,在mRNA水平, qPCR結果顯示TIPE2基因過表達比對照組高30多倍(P<0.05),在蛋白水平,Western Blotting結果顯示TIPE2基因過表達后的表達量也是增高的。qPCR結果顯示,TIPE2基因過表達后使TIPE3的表達量上調(P<0.05),而對TNFAIP8和TIPE1沒有太大的影響(P>0.05

7、)。臺盼藍染色人工計數(shù)結果顯示TIPE2基因過表達后Jurkat細胞生長增快(P<0.05)。用流式細胞術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)無明顯變化(P>0.05),細胞凋亡也沒明顯變化(P>0.05),Western Blot結果顯示并沒有激活Caspase3和Caspase8,所以這兩方面說明TIPE2不影響細胞的凋亡。利用NBT方法檢測細胞的分化情況,結果沒有明顯的差異(P>0.05)。利用Transwell小室檢測細胞遷移的情況,發(fā)現(xiàn)TIPE2

8、過表達后細胞的遷移能力增強了(P<0.05)。Western Blott結果顯示,TIPE2過表達后PCNP的表達量降低(P<0.05)而JNK1的表達量增加(P<0.05)。將PCNP和JNK1分別沉默和過表達后發(fā)現(xiàn),PCNP通過影響細胞周期來影響細胞的生長(P<0.05),但對細胞凋亡沒有影響(P>0.05),對細胞分化沒有明顯的影響(P>0.05),對細胞的遷移沒有明顯影響(P>0.05)。而JNK1對細胞的生長、凋亡、分化和遷移

9、都沒有明顯的影響(P>0.05)。Western Blot結果顯示PCNP對TIPE2有影響而對JNK1沒有影響,而JNK1對TIPE2沒有影響對PCNP有影響。這就說明三者之間相互作用從而影響細胞的生物學功能。
　　結論：
　　1.TIPE2可以通過影響PCNP和JNK1來影響Jurkat細胞的生長,但對細胞凋亡沒有影響。TIPE2可以影響Jurkat細胞的遷移,并與之呈正比;
　　2.PCNP可以通過影響細胞周期來