TIPE2在尼古丁抗炎通路中的作用機(jī)制研究.pdf

1、“膽堿能抗炎通路”是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng).免疫調(diào)節(jié)通路,其激活可有效減少多種促炎因子的釋放,對(duì)全身和局部炎癥均具有明顯抑制作用。尼古丁,作為一種膽堿能受體激動(dòng)劑,其藥理作用與乙酰膽堿Ach相似,可有效減輕炎癥反應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道尼古丁能夠降低促炎因子所引起的細(xì)胞因子。TNF-α、IL-12、IL-6的釋放。但到目前為止,尼古丁抗炎通路的分子機(jī)制尚不清楚。TIPE2是最近發(fā)現(xiàn)的一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)分子,屬于TNFAIP8家族,主要表達(dá)在胸腺、脾臟、淋巴

2、結(jié)以及小腸粘膜等免疫器官和淋巴組織中,對(duì)適應(yīng)性免疫和固有免疫起到負(fù)性調(diào)控作用。但TIPE2是否參與尼古丁所介導(dǎo)的抗炎過程,以及在其中可能所起的作用及機(jī)制尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本課題首先采用皮下注射的方法給予小鼠持續(xù)的尼古丁刺激,以流式細(xì)胞術(shù)、ELISA檢測小鼠脾細(xì)胞在抗原刺激下TNF-α、IL-4、IL-2及IL-12的表達(dá)情況;其次,體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞,尼古丁刺激后,以流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS所致的細(xì)胞因子TNF-α的釋放;再次,以Wester

3、nblot、激光共聚焦研究尼古丁對(duì)巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞NF-κB通路的影響;繼以Western blot、流式細(xì)胞術(shù)探究尼古丁對(duì)巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞中TIPE2、α7 nAchR表達(dá)的調(diào)控,以及α7 nAchR在尼古丁調(diào)控TIPE2表達(dá)中的作用;最后,以Western blot檢測TIPE2過表達(dá)對(duì)NF-κB通路的影響,從而初步闡明尼古丁通過NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):①體內(nèi)持續(xù)尼古丁刺激可使促炎因子

4、所致的小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞TNF-α、IL-4、IL-2以及IL-12的陽性細(xì)胞率分別由20％、14％、36％和75％降為13％、6％、15％和19％,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12、IL-4的濃度分別由1625、425 pg/ml降為139、153 pg/ml;在體外,尼古丁刺激降低LPS引起的巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá),這種降低可以被尼古丁受體阻斷劑BTX逆轉(zhuǎn)。②尼古丁處理可明顯抑制LPS所致的巨噬細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞IκBα的

5、磷酸化、降解以及p65、p50、p52的核轉(zhuǎn)位。③在蛋白水平上,尼古丁刺激可明顯上調(diào)RAW264.7細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞TIPE2的表達(dá)。④尼古丁刺激可上調(diào)巨噬細(xì)胞及小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞α7 nAChR的表達(dá);同時(shí),尼古丁α7 nAchR特異性拮抗劑α銀環(huán)蛇毒素BTX或非特異性阻斷劑筒箭毒堿Tc能夠阻斷尼古丁對(duì)TIPE2的上調(diào)作用,且BTX阻斷效果更明顯。⑤TIPE2過表達(dá)明顯抑制IκBα的磷酸化、降解以及p65、p50、p52的核