慢病毒介導的星形膠質(zhì)細胞升高基因-1表達下調(diào)對肝星狀細胞生物學行為的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是由于各種慢性肝病反復損傷導致的以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積為特征的病理生理過程，其病因主要包括病毒感染、非酒精或酒精性脂肪性肝炎、免疫損傷和膽汁淤積等。包括肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)在內(nèi)的不同來源的肝臟肌成纖維細胞是此病理生理過程的主要驅(qū)動因素。
　　靜態(tài)的HSCs富含維生素A，位于肝細胞及竇內(nèi)皮細胞

2、之間的狄氏間隙。肝臟受到損傷時，細胞內(nèi)維生素A脂滴消失，靜態(tài)HSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞。這一轉(zhuǎn)化過程對肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，稱作靜態(tài)HSCs的“激活”?；罨腍SCs被賦予了多種能力，包括增殖速度加快、ECM分泌增加、遷移能力提高等。
　　目前，肝纖維化尚缺乏有效治療手段。肝纖維化逆轉(zhuǎn)需要纖維瘢痕降解消退，此基于膠原分泌細胞數(shù)量減少、能力弱化。已有研究證實活化的HSCs是最主要的促纖維化因素，因此，清除活化的HSCs、抑

3、制其增殖、誘導凋亡、抑制其膠原分泌及遷移能力，是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵治療靶點和重要策略。
　　星型膠質(zhì)細胞升高基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)，也被稱作異粘蛋白(metadherin，MTDH)，于2002年在人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor, TNF-α)感染的星型膠質(zhì)細胞中首次

4、被發(fā)現(xiàn)。在過去的十余年間，對AEG-1的研究多集中在與腫瘤的關(guān)系上，包括乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細胞瘤及肝癌等。研究認為，AEG-1能夠促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤的預后密切相關(guān)，被認為是一種癌基因。例如，AEG-1在肝細胞癌中高表達，且表達量與癌癥分期相關(guān)，表達越高則預后較差。近年來，隨著國內(nèi)外學者研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)AEG-1的功能并非只是局限在腫瘤范圍，在非腫瘤的生理、病理過程中也發(fā)揮著重要作用，如生長發(fā)育、炎癥、神經(jīng)退行性變等

5、。這也促進人們對此基因功能譜的認識及內(nèi)在機制的研究日益深入。
　　AEG-1可通過多條信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用，最重要的有磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/Akt、核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)等通路，而這些通路在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要作用。研究證明，

6、在多種細胞中過表達AEG-1可促進細胞的增殖及侵襲、遷移能力，抑制其凋亡。更重要的是，上調(diào)AEG-1能促進細胞的炎癥反應及血管新生能力，而這些也是肝纖維化形成的關(guān)鍵因素。但迄今為止，AEG-1與肝纖維化及HSCs之間的關(guān)系尚無報道。
　　本課題旨在研究AEG-1在肝纖維化形成及活化HSCs中的表達，應用慢病毒介導的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)下調(diào)AEG-1表達后，觀察其對HSCs細胞活化、凋亡和遷移

7、等生物學行為的影響，并進一步研究導致此些影響所涉及的信號轉(zhuǎn)導通路。本學位論文由以下四部分組成:
　　第一部分、星形膠質(zhì)細胞升高基因-1在肝纖維化大鼠肝組織及活化HSCs中的表達
　　目的:研究AEG-1在大鼠纖維化肝臟及促纖維化因子刺激后HSCs中的表達。
　　方法:應用膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)及二甲基亞硝胺(dimethyl-nitrosamine，DMN)腹腔注射兩種方法建立大鼠肝

8、纖維化模型。BDL模型組結(jié)扎膽總管，假手術(shù)組只分離膽總管不結(jié)扎，均于術(shù)后2wk取材。DMN模型組腹腔注射1％DMN，每周連續(xù)3d，對照組腹腔注射生理鹽水，均于4 wk后取材。肝組織石蠟切片經(jīng)HE與天狼星紅染色(Sirius Red)檢測肝臟病理變化。免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)觀察AEG-1的表達及定位。Western blot及RT-real time PCR檢測AEG-1蛋白及mRNA的表達。采

9、用原位灌流、梯度密度離心技術(shù)分離大鼠原代HSCs，倒置熒光顯微鏡觀察剛分離靜止的大鼠原代HSCs，應用免疫細胞化學染色技術(shù)檢測α-SMA表達以鑒定活化的大鼠原代HSCs。應用細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS∶0μg/ml，0.5μg/ml，1.5μg/ml)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β∶0 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml)刺激HSC-

10、T624 h，應用LPS(1.5μg/ml)或TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6或原代大鼠HSCs0 h，24 h或48 h，Western blot檢測干預前后AEG-1蛋白的表達變化。
　　結(jié)果:
　?、貶E與天狼星紅染色結(jié)果證明BDL和DMN誘導的大鼠肝纖維化模型成功建立。BDL誘導的纖維化模型可見肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，大量膠原沉積，膽管明顯擴張和增生;DMN誘導的肝纖維化模型除肝臟結(jié)構(gòu)紊亂外，尚可見明顯的出血性壞死

11、、肝竇充血及大量炎細胞浸潤。
　　②免疫組織化學法染色顯示，BDL及DMN誘導的肝纖維化大鼠肝臟細胞AEG-1表達明顯升高，主要定位于細胞質(zhì)，而對照組基本無表達。
　?、踂estern blot及RT-real time-PCR檢測顯示，BDL及DMN模型組較對照組AEG-1均明顯升高(P＜0.05）。
　?、躎GF-β(0 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml)刺激HSC-T624 h，5 ng/ml刺激組A

12、EG-1蛋白水平無明顯升高，10 ng/ml組AEG-1蛋白水平明顯升高。應用10 ng/ml TGF-β刺激HSC-T624 h及48 h，結(jié)果顯示，48 h刺激組較24 h組AEG-1蛋白水平進一步升高(P＜0.05）。
　　⑤LPS(0μg/ml,0.5μg/ml,1.5μg/ml)刺激HSC-T624 h,0.5μg/ml刺激組AEG-1蛋白水平無明顯升高，1.5μg/ml組AEG-1蛋白水平明顯升高。應用1.5μg/ml

13、 LPS刺激HSC-T624 h及48 h，結(jié)果顯示，48 h刺激組較24 h組AEG-1蛋白水平進一步升高（P＜0.05）。
　?、薏捎酶闻K原位灌注鏈酶和膠原酶，以Nycodenz為介質(zhì)，密度梯度離心一步法成功分離出大鼠原代HSCs。細胞得率為1.0×107至1.5×107/只，細胞存活率和純度均大于90％。在倒置顯微鏡下觀察剛分離的HSCs呈圓形，胞漿中富含脂滴，在波長328 nm的熒光顯微鏡下觀察，剛分離的原代HSCs呈自發(fā)

14、藍色熒光。培養(yǎng)至14d，大鼠HSCs呈活化狀態(tài)，脂滴消失，變成梭形肌成纖維樣細胞。
　?、咴鶫SCs性質(zhì)鑒定。剛分離的HSCs免疫細胞化學染色α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達陰性;原代培養(yǎng)14 d后α-SMA陽性染色率達100％。
　?、鄳?0 ng/mlTGF-β及1.5μg/ml LPS刺激原代大鼠HSCs24 h及48 h，刺激24 h組AEG-1蛋白表達無明顯升高，

15、刺激48 h組AEG-1蛋白表達則明顯升高(P＜0.05）。
　　結(jié)論:AEG-1在大鼠BDL及DMN誘導的肝纖維化組織中明顯升高。TGF-β及LPS刺激HSC-T6及原代大鼠HSCs可使AEG-1表達升高，且呈時間、劑量依賴性。
　　第二部分、星形膠質(zhì)細胞升高基因-1表達下調(diào)對肝星狀細胞活化的影響
　　目的:構(gòu)建慢病毒介導的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)下調(diào)AEG-1的表達，觀察其對H

16、SC-T6細胞增殖、凋亡及膠原合成的影響。
　　方法:設(shè)計并合成可抑制AEG-1表達的shRNA，根據(jù)轉(zhuǎn)染率摸索出適合靶細胞的感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，轉(zhuǎn)染進入HSC-T6細胞中。利用westem blot和RT-real-time PCR方法檢測AEG-1蛋白和mRNA表達情況，篩選出一條抑制效率最高的shRNA。成功下調(diào)HSC-T6的AEG-1表達后，CCK-8(Cell Coun

17、ting Kit-8)檢測細胞增殖;流式細胞學分析細胞周期變化;western blot和RT-real time PCR方法檢測Ⅰ型膠原及α-SMA水平的變化。
　　結(jié)果:
　　①通過預實驗摸索出MOI值為20。轉(zhuǎn)染進入細胞后，根據(jù)蛋白及mRNA檢測結(jié)果，所設(shè)計的3條shRNA質(zhì)粒片段均可顯著抑制AEG-1蛋白及基因的表達，蛋白干擾的效果分別達到75.22％、60.21％及64.36％，mRNA表達分別下降85.52％、6

18、9.96％及71.10％，與空白對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05）。
　?、谙抡{(diào)AEG-1表達促進了HSC-T6細胞增殖，培養(yǎng)24 h，Lenti-shAEG-1組(1.13±0.13)較Lenti-shCon組(1.57±0.22)明顯下降(P＜0.05）。培養(yǎng)48 h，Lenti-shAEG-1組(1.49±0.19)較Lenti-shCon組(2.12±0.24)進一步下降(P＜0.01）。Lenti-shCon組與u

19、ninfected組相比均無明顯變化。
　?、哿魇郊毎麑W檢測下調(diào)AEG-1表達可影響HSC-T6的細胞周期。Lenti-shAEG-1組(48.67±4.35％)較Lenti-shCon組(29.70±3.08％) G0/G1期細胞比例上升(P＜0.05），而G2/M期細胞比例下降(4.90±1.71 vs15.07±3.37，P＜0.05)，表明細胞被阻滯在G0/G1期。
　?、芟抡{(diào)AEG-1后，HSC-T6的α-SMA的

20、蛋白(0.31±0.11 vs0.78±0.12，P＜0.05)及mRNA(0.57±0.27 vs1.14±0.23，P＜0.05)水平較陰性對照組分別下降了60.32％及41.34％。
　?、茛裥湍z原蛋白(0.36±0.12 vs0.73±0.23，P＜0.05)及mRNA(0.57±0.11 vs0.99±0.11，P＜0.05)水平較陰性對照組分別下降了50.72％及42.54％。而兩者的陰性對照組較未感染組無明顯變化。<

21、br>　　結(jié)論:成功構(gòu)建靶向AEG-1的shRNA并下調(diào)AEG-1表達。下調(diào)AEG-1表達可抑制HSC-T6的活化。
　　第三部分、星形膠質(zhì)細胞升高基因-1表達下調(diào)誘導肝星狀細胞凋亡、抑制遷移
　　目的:觀察shRNA下調(diào)AEG-1表達后對HSC-T6細胞的凋亡和遷移的影響。
　　方法:下調(diào)HSC-T6的AEG-1表達后，膜聯(lián)蛋白(Annexin(Ⅴ))/藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)聯(lián)合標記流式細胞術(shù)檢

22、測HSCs凋亡率;末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記(terminaldeoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL)檢測HSC-T6凋亡;掃描電鏡觀察細胞形態(tài);RT-Real time PCR測定caspase-3 mRNA的表達;劃痕實驗及Transwell小室檢測細胞遷移。
　　結(jié)果:
　?、傧抡{(diào)AEG-1后，HSC-T6的TUNEL

23、染色陽性細胞率較對照組提高了1.93倍（P＜0.05）。
　?、诹魇郊毎夹g(shù)檢測顯示，下調(diào)AEG-1表達后，Lenti-shAEG-1組細胞凋亡率(27.12±5.72％)較Lenti-shCon組（8.88±3.20％）及uninfected(7.97±2.52％)組明顯升高(P＜0.01）。
　?、跘EG-1shRNA干擾HSC-T6細胞后，與陰性對照組相比，細胞體積縮小，細胞表面微絨毛縮短，偽足縮短或消失。
　　

24、④下調(diào)AEG-1升高了Caspase-3的mRNA表達，Lenti-shAEG-1組較Lenti-shCon組升高了1.86倍(P＜0.05)。
　　⑤劃痕愈合實驗:劃痕后培養(yǎng)24 h，Lenti-shAEG-1組劃痕愈合率(0.41±0.06)較Lenti-shCon組(0.56±0.05)下降26.8％(P＜0.05)。培養(yǎng)48 h后，劃痕愈合率Lenti-shAEG-1組(0.59±0.13)較Lenti-shCon組(0.

25、88±0.12)下降33.7％(P＜0.05)。
　?、轙ranswell assay實驗:Tanswell小室中接種細胞后，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，Lenti-shAEG-1組細胞遷移數(shù)(18.20±3.44)較Lenti-shCon組(46.60±4.85，P＜0.05)降低了71.21％。
　　結(jié)論:下調(diào)AEG-1表達后，可以促進HSC-T6的凋亡，抑制其遷移。
　　第四部分、星形膠質(zhì)細胞升高基因-1調(diào)

26、控肝星狀細胞生物學行為的信號轉(zhuǎn)導機制
　　目的:研究慢病毒介導shRNA下調(diào)AEG-1表達對HSC-T6細胞內(nèi)PI3K/Akt、ERK及P38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:慢病毒介導的shRNA下調(diào)HSC-T6的AEG-1表達后，Westernblot檢測PI3K/Akt及ERK、P38 MAPK磷酸化及總蛋白活化表達情況。
　　結(jié)果:
　?、傧抡{(diào)AEG-1表達可以抑制PI3K、Akt水平，而對總

27、蛋白無明顯影響。ShAEG-1組與shCON組比較，p-PI3K/PI3K、p-AktThr308/Akt和p-AktSer473/Akt明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　?、谙抡{(diào)AEG-1表達可以抑制ERK、P38 MAPK水平，而對總蛋白無明顯影響。ShAEG-1組與shCON組比較，p-ERK/ERK和p-P38/P38明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:下調(diào)AEG-1表達對HSC-T6生物學行為的調(diào)控可能是通過抑制PI