慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾RRS1基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，在世界惡性腫瘤中發(fā)病率第五，死亡率第三，其發(fā)病率和死亡率逐年增加。肝癌早期臨床癥狀不典型，但病程發(fā)展迅速，死亡率極高，使人類的健康受到了極大的挑戰(zhàn)。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，通過基因工程技術(shù)將外源或內(nèi)源的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)導(dǎo)入目的細胞，能夠靶向降解目的基因mRNA，可阻斷靶基因的功能表達

2、，進而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾技術(shù)的不斷進步能夠為惡性腫瘤的早期診斷及靶向治療提供了一種新的方法。
　　近些年來研究發(fā)現(xiàn)核糖體的生物合成和活性與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。核糖體合成調(diào)控因子1(Regulator of ribosome synthesis1，RRS1)是一個具有203個氨基酸的真核生物保守的細胞核蛋白。RRS1可以根據(jù)細胞的狀態(tài)調(diào)節(jié)核糖體合成的速度，從而保持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，是蛋白質(zhì)分泌與核糖體的合成的信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個重要蛋白質(zhì)。前期研究證實RRS1蛋白在人肝癌組織的表達較癌旁組織明顯增加，但RSS1是否參與肝癌惡性生物學(xué)行為的調(diào)控及其可能的調(diào)控機制尚不明確。
　　本實驗通過構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的RRS1-siRNA表達載體，經(jīng)基因測序法鑒定后成功轉(zhuǎn)染到人肝癌細胞SMMC-7721，進一步選用Western blot(WB)技術(shù)及RT-PCR檢測RRS1 mRNA、RSS1表達量的改變，并利用利用Cellomics檢測RRS1基因干

4、擾前后SMMC-7721細胞的增殖能力的變化;流式細胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測RRS1基因干擾后細胞生長、細胞周期分布及細胞凋亡比例的變化，探討慢病毒介導(dǎo)的RRS1基因沉默后針對肝癌SMMC-7721細胞中RRS1 mRNA、RSS1蛋白表達水平的變化以及對細胞增長、細胞周期分布、細胞凋亡等生物學(xué)行為的影響。
　　實驗結(jié)果表明:1.成功構(gòu)建了pGCSIL-GFP-RRS1載體，經(jīng)基因測序證實插入序列符合設(shè)計要

5、求，共轉(zhuǎn)染293T細胞，生產(chǎn)出含有LV-RRS1-shRNA的重組慢病毒，進一步測定其滴度為8×108 TU/mL。2.重組慢病毒感染肝癌細胞株，與Lv-shCon組相比，Lv-shRRS1組SMMC-7721中的RRS1的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平顯著下降，分別下降68％和73％。3.與Lv-shCon組相比，Lv-shRRS1組細胞增殖能力顯著降低。4.Lv-shCon組凋亡率為(8.15+0.33)％，明顯低于Lv-shRRS1組細

6、胞凋亡率為(36.5+0.19)％(P＜0.01)。5.與Lv-shCon組相比，Lv-shRRS1組細胞周期分布發(fā)生改變，G1期細胞數(shù)量顯著增多(P＜0.01)，S期及G2/M期細胞數(shù)量明顯降低，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。
　　通過本實驗得出以下結(jié)論:1.成功構(gòu)建了靶向RRS1 mRNA的siRNA慢病毒表達載體，構(gòu)建RRS1 shRNA慢病毒感染SMMC-7721細胞株，經(jīng)檢測可顯著地抑制RRS1基因的表達，為進一步