慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾RRS1基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、肝癌是世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界惡性腫瘤中發(fā)病率第五，死亡率第三，其發(fā)病率和死亡率逐年增加。肝癌早期臨床癥狀不典型，但病程發(fā)展迅速，死亡率極高，使人類的健康受到了極大的挑戰(zhàn)。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，通過(guò)基因工程技術(shù)將外源或內(nèi)源的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)導(dǎo)入目的細(xì)胞，能夠靶向降解目的基因mRNA，可阻斷靶基因的功能表達(dá)

2、，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾技術(shù)的不斷進(jìn)步能夠?yàn)閻盒阅[瘤的早期診斷及靶向治療提供了一種新的方法。
　　近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)核糖體的生物合成和活性與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。核糖體合成調(diào)控因子1(Regulator of ribosome synthesis1，RRS1)是一個(gè)具有203個(gè)氨基酸的真核生物保守的細(xì)胞核蛋白。RRS1可以根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)調(diào)節(jié)核糖體合成的速度，從而保持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，是蛋白質(zhì)分泌與核糖體的合成的信

3、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要蛋白質(zhì)。前期研究證實(shí)RRS1蛋白在人肝癌組織的表達(dá)較癌旁組織明顯增加，但RSS1是否參與肝癌惡性生物學(xué)行為的調(diào)控及其可能的調(diào)控機(jī)制尚不明確。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的RRS1-siRNA表達(dá)載體，經(jīng)基因測(cè)序法鑒定后成功轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，進(jìn)一步選用Western blot(WB)技術(shù)及RT-PCR檢測(cè)RRS1 mRNA、RSS1表達(dá)量的改變，并利用利用Cellomics檢測(cè)RRS1基因干

4、擾前后SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力的變化;流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)RRS1基因干擾后細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡比例的變化，探討慢病毒介導(dǎo)的RRS1基因沉默后針對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞中RRS1 mRNA、RSS1蛋白表達(dá)水平的變化以及對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1.成功構(gòu)建了pGCSIL-GFP-RRS1載體，經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)插入序列符合設(shè)計(jì)要

5、求，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，生產(chǎn)出含有LV-RRS1-shRNA的重組慢病毒，進(jìn)一步測(cè)定其滴度為8×108 TU/mL。2.重組慢病毒感染肝癌細(xì)胞株，與Lv-shCon組相比，Lv-shRRS1組SMMC-7721中的RRS1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降，分別下降68％和73％。3.與Lv-shCon組相比，Lv-shRRS1組細(xì)胞增殖能力顯著降低。4.Lv-shCon組凋亡率為(8.15+0.33)％，明顯低于Lv-shRRS1組細(xì)

6、胞凋亡率為(36.5+0.19)％(P＜0.01)。5.與Lv-shCon組相比，Lv-shRRS1組細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P＜0.01)，S期及G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯降低，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。
　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論:1.成功構(gòu)建了靶向RRS1 mRNA的siRNA慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建RRS1 shRNA慢病毒感染SMMC-7721細(xì)胞株，經(jīng)檢測(cè)可顯著地抑制RRS1基因的表達(dá)，為進(jìn)一步