攜帶SOCS1基因腺病毒的構建及其對樹突狀細胞生物學特性和功能的作用機制.pdf

1、樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)是體內最重要的抗原提呈細胞,能夠啟動初始T細胞活化、增殖、分化并產生免疫效應,在免疫系統(tǒng)中居于獨特的地位。成熟DCs能夠激發(fā)免疫應答,而不成熟DCs則涉及免疫耐受的誘導。利用DC的免疫調節(jié)作用,誘導免疫耐受是當前移植領域的研究熱點。研究表明,髓系未成熟DC亞群(immature DC subset,imDC)或靜息DC(resting DC)由于表面黏附輔佐分子如B7、ICAM-1、C

2、D40等缺乏,因此具有免疫耐受性,可以誘導T細胞失能(anergy)、低反應性及向Th2細胞極化,并誘導調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)產生,未成熟DC的這些效應對器官移植時免疫穩(wěn)定態(tài)的維持具有重要的作用。因此,研究調節(jié)DCs發(fā)育成熟的因素及其機制,對于闡明自身免疫病、移植排斥反應、抗腫瘤免疫等的機制和探索防治措施有著重要的意義。 細胞因子信號轉導抑制分子(Supressors of cytokin

3、e signaling,SOCS)是1997年Starr、Endo和Naka所在的三個不同的實驗小組,用不同的方法相繼發(fā)現的一類與細胞因子JAK-STAT信號轉導途徑有關的負性調節(jié)因子。SOCS能抑制ILs、IFN-γ、GH等多種細胞因子的信號轉導途徑,不僅對JAK-STAT信號途徑有負性調控作用,而且還參與其它信號途徑的調節(jié),其功能涉及機體正常組織的分化和器官的發(fā)育,因此為學術界廣泛關注。SOCS通過選擇性抑制IL-12/STAT4或

4、IL-4/STAT6途徑的信號傳導,實現對Th細胞的分化調控,其平衡紊亂導致自身免疫性疾病的發(fā)生。 SOCS1為該家族中含SH2結構域的SOCS成員之一,又稱JAB(JAK binding protein)或SSI1(STAT induced STAT inhibitor 1)。正常生理條件下,SOCS1蛋白分子表達量很少；在細胞受到某些細胞因子刺激時,其表達量可迅速明顯地增加。研究表明當機體受到刺激以后,SOCS1的mRNA在

5、胸腺細胞內的豐度顯著增加；在肺、脾和睪丸等器官中等增加。在體外,SOCS1可以抑制多種信號傳導途徑,在細胞中超表達時可以抑制IFNs、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-12、TNF-α、LIF、OSM(抑瘤素M)等細胞因子的信號轉導。SOCS1通過抑制由ILs、IFN以及LIF等所誘導的STAT活性以及Tec激酶和受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)的活性,調控細胞的分化與功能。

6、 考慮到DC在抗原遞呈和免疫激活與耐受過程中的特殊作用,尤其是體內imDC亞群的產生與細胞因子信號調控密切相關,針對SOCS1負性調節(jié)IFN-γ、ILs等細胞因子信號的傳導可能對imDC亞群產生具有重要的作用,我們擬研究在DC分化、發(fā)育和抗原遞呈過程中,SOCS1的表達及對其影響的因素,探討SOCS1高表達對DC成熟、生物學特性和功能的影響,LPS等炎癥因子刺激在其中的作用,以及誘導T細胞耐受的效果。目前對于SOCS1和DC之間相互關系

7、的研究主要集中在干擾SOCS1表達方面,而對于高表達SOCS1對DC的影響則鮮有報道。近期研究顯示,用RNA干擾技術沉默DC的SOCS1基因表達,能促使DC成熟而增強其免疫原性。且Sakurai[49]等研究發(fā)現在巨噬細胞中高表達SOCS1能夠明顯抑制腺病毒本身所誘導的初始免疫反應。因此,在理論上用細胞轉基因技術上調DC的SOCS1基因表達,能抑制DC成熟而增強其耐受原性。鑒于此,我們構建了高表達SOCS1的腺病毒載體,轉染小鼠骨髓來源

8、的DC(BMDC),檢測BMDCs的表型、吞噬能力、細胞因子分泌以及刺激同種異體T細胞增殖的能力以及對細胞信號通路的影響,以驗證SOCS1的高表達是否能夠抑制DC成熟并增強其耐受原性。 第一部分SOCS1腺病毒載體的構建及其修飾的小鼠BMDC的制備 腺病毒載體因其具有基因組結構簡單、宿主細胞范圍廣、滴度高、感染效率高、無插入突變危險等優(yōu)勢,因此我們選擇了AdEasyTM Adenoviral Vector System體

9、系構建SOCS1載體。首先取經過LPS刺激4小時后的小鼠脾臟,抽提其mRNA,然后根據報道及Genebank發(fā)布的基因和蛋白序列,設計帶酶切位點的特異性引物,RNA逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增獲得小鼠SOCS1全長基因序列,雙酶切后連接到AdEasyTM Adenoviral Vector System體系中的pShuttle-CMV中,然后與pAdeasy-1同源重組,在293A細胞中包裝出帶有SOCS1目的基因的腺病毒pAdes

10、y-SOCS1。通過PCR、酶切、測序鑒定及Westernblot檢測,結果顯示,攜帶小鼠SOCS1基因的腺病毒載體可高表達SOCS1蛋白,說明帶有目的基因SOCS1的腺病毒構建成功。經過病毒的擴增及滴度檢測,我們構建的小鼠pAdeasy-SOCS1腺病毒獲得了較高的滴度。 采用GM-CSF和IL-4共同刺激小鼠骨髓細胞,培養(yǎng)小鼠BMDC。此法培養(yǎng)的DC在5-7天時大部分為未成熟DC小集落,經LPS、CpG或PolyI:C刺激2

11、4-36小時后,DC表面可伸出大量很長的突起；經過流式細胞儀檢測,BMDC的純度可以達到80％以上,符合實驗的要求。實驗分為三組：第一組正常BMDC組(DC only);第二組空病毒pAdeasyTM-VNG轉染小鼠BMDC,形成空病毒對照組(DC+pAdeasy-VNG);第三組將pAdeasyTM-SOCS1轉染BMDC,形成SOCS1高表達組(DC+pAdcasy-SOCS1)。普通顯微鏡下觀察發(fā)現高表達SOCS1的BMDCs所形

12、成的集落明顯的小且突起少而鈍；熒光顯微鏡下觀察發(fā)現大約80％BMDCs發(fā)出綠色熒光；同時RT-PCR和Westernblot檢測上述BMDCs的SOCS1基因和蛋白的表達情況。與對照組相比,實驗組SOCS1蛋白的表達明顯增多。但由于病毒載體的影響,與BMDCs相比,空病毒對照組也有少量的SOCS1蛋白的表達。結果證實構建的pAdeasy-SOCS1腺病毒能有效介導SOCS1基因在小鼠BMDCs中表達,且空病毒可以誘導BMDCs微量的表達

13、SOCS1。 第二部分高表達SOCS1對BMDC生物學特性和功能的影響 在本部分,BMDCs被分為6組,施以不同的刺激條件。A組：培養(yǎng)過程中不加任何刺激的空白對照組(DC only);B組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-VNG空病毒對照組(DC+pAdeasyTM-VNG);C組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-SOCS1實驗組(DC+pAdeasyTM-SOCS1);D組：培養(yǎng)過程中不加任何刺激的空白對照組,檢測

14、前24小時再加入LPS刺激(LPS+DC);E組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-VNG空病毒對照組,檢測前24小時再加入LPS刺激(LPS+DC+pAdeasyTM-VNG組);F組：培養(yǎng)第5天加入pAdeasyTM-SOCS1檢測前24小時再加入LPS刺激(LPs+DC+pAdeasyTM-SOCS1組)。經過FACS、ELISA等實驗手段檢測,我們發(fā)現高表達SOCS1,能夠明顯抑制BMDCs表面分子CD40、CD80、CD86和

15、MHC II分子的表達；BMDCs攝取抗原能力維持在高水平而刺激異記憶T細胞增殖能力不足；同時伴隨著IL-12p40、IL-6、IFN-γ、及TNF-α等細胞因子分泌水平的降低?？詹《窘M則恰恰相反,在一定程度上刺激了BMDCs的成熟。但高表達SOCS1能夠明顯抑制空病毒所誘導的BMDCs的成熟作用。 此外,NF-κB在TLR誘導的DC成熟過程中起十分重要作用,主要參與了細胞因子的分泌調節(jié)。SOCS1、P13K、PKCs等信號分子

16、通過NF-κB、p38MAPK和JNK的激活而調控DC的成熟和細胞因子的分泌。因此,我們選擇其中兩個重要的相關信號分子,即NF-κB和JNK,初步探索高表達SOCS1對BMDCs信號通路的調節(jié)作用。結果發(fā)現高表達SOCS1的BMDCs中p65表達量明顯降低,JNK的表達量有所升高；而LPS刺激后高表達SOCS1的BMDCs中p65表達量略微降低,JNK的表達量明顯降低。因此,我們推測高表達SOCS1的BMDCs在信號調節(jié)的過程中,主要是