ICOSL-ICOS逆向信號調控樹突狀細胞生物學功能研究.pdf

1、本課題中,我們利用前期真核表達的具有生物活性的人ICOSIg融合蛋白和構建的膜表達ICOS的CHO細胞株,研究ICOS是否向樹突狀細胞傳遞逆向信號及該逆向信號是否可以引起DCs相應功能的改變,進一步深入探討ICOSL/ICOS通路信號傳遞的本質和內(nèi)在機制,全面的了解ICOS/ICOSL配受體相互作用對機體免疫平衡調節(jié)的重要作用。 研究內(nèi)容： 第一部分,主要研究前期構建的人ICOSIg與小鼠骨髓來源的樹突狀細胞體外特異性的

2、結合、驗證其生物學活性、研究可溶性ICOSIg蛋白本身對DCs的是否具有毒性作用,為后續(xù)研究ICOSIg與DCs表面ICOSL結合傳遞逆向信號的可行性提供實驗依據(jù)。 第二部分,主要研究ICOSIg結合小鼠骨髓體外誘導培養(yǎng)第5天不成熟DCs表面ICOSL后,能否引起DCs相應的功能變化。檢測指標包括:DCs表型分子的變化、DCs分泌細胞因子的變化、DCs吞噬功能改變、DCs抗原遞呈功能改變、DCs對同種異基因T細胞刺激增殖能力變化

3、。另外還利用體外構建的表達膜錨定ICOS的CHO細胞株,模擬體內(nèi)細胞與細胞之間的相互作用,對可溶性ICOSIg蛋白的生物學功能進行驗證。 第三部分,由于研究發(fā)現(xiàn),針對共刺激分子另一家族成員PD-1配體PD-L2的抗體,作用于成熟DCs,可向DCs傳遞逆向信號,誘導產(chǎn)生了一種兼俱較強抗原攝取和抗原遞呈功能并有成熟DCs表型的新的一類DCs細胞。我們也擬進一步研究ICOSIg作用于成熟過程中和成熟后的DCs,能否引起DCs的功能改變

4、。 第四部分,由于體外研究缺少體內(nèi)復雜環(huán)境因素相互作用的影響,我們借鑒文獻建立皮膚過敏反應的動物模型,在體內(nèi)進一步驗證體外觀察到的實驗現(xiàn)象并進行相關機制的探討。 實驗方法： 采用流式細胞儀檢測ICOSIg與其配體的特異性結合、實驗處理后各DCs或T細胞表面分子的變化、胞內(nèi)細胞因子變化、DCs的吞噬功能等；采用ELISA和實時熒光定量RT-PCR的方法檢測各種培養(yǎng)上清中和培養(yǎng)細胞內(nèi)的多種細胞因子、趨化因子、表面分子

5、的表達變化；采用Annexin V/PI復染檢測不同因素處理后細胞凋亡的變化；采用CCK-8檢測可溶性蛋白對DCs細胞的毒性和促增殖作用；采用3H-TdR摻入檢測DCs細胞抗原遞呈功能和刺激異基因T細胞增殖能力；采用WesternBlot方法檢測實驗組表達p38總蛋白和磷酸化蛋白的表達情況；采用小鼠皮膚過敏反應的模型,體內(nèi)驗證ICOSIg的生物學功能。 實驗結果： 第一部分,研究結果表明,體外誘導培養(yǎng)的DCs表面,有一定

6、程度的ICOSL的表達,且ICOSL的表達隨DCs細胞的成熟而逐漸下調。為了驗證體外表達可溶性人ICOSIg與小鼠DCs特異性結合,我們先將DCs用CD16/32封閉,然后與ICOSIg或人IgG共孵育,再加入熒光標記抗人IgG二抗,可檢測到ICOSIg與DC的結合,而對照IgG與DC無結合；為進一步驗證其結合的特異性,我們用不同濃度的ICOSIg與PE標記的抗鼠ICOSL抗體同時作用于DC,結果發(fā)現(xiàn)抗ICOSL抗體與DC結合受到不同程

7、度的阻斷；如果先加入ICOSIg與DC共孵育,則ICOSIg可完全阻斷抗鼠ICOSL抗體與DC的結合。同時借助于Annexin v/PI染色和CCK-8試劑盒,我們也發(fā)現(xiàn)ICOSIg處理過程中,DCs死亡或凋亡情況與對照組相比沒有明顯變化。同時,人源ICOSIg可在體外抑制不同品系小鼠脾臟單個核細胞的混合淋巴細胞反應,更表明其具有生物學活性。 第二部分,我們首先用可溶性ICOS蛋白與骨髓單個核細胞來源DCs(5天,未成熟)共孵育

8、,檢測培養(yǎng)上清細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1表達。其中IL-2、IL-4低于試劑盒檢測下限,ICOSIg不改變DCs分泌IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1細胞因子的表達變化；而DCs表達IL-6水平隨融合蛋白ICOSIg濃度的增加而明顯上調。定量RT-PCR表明各實驗組DCs表達TGF-β1,PGE2,CCL3,CCL4和CCL19無明顯差異,

9、但ICOSIg處理組IL-10有部分升高。與此同時,流式細胞儀檢測表明ICOS處理組DCs表達共刺激分子CD83、CD80、CD86和Iab表達均比對照組有相應的提高,而ICOSL低于對照。進一步定量RT-PCR檢測ICOSL mRNA水平結果表明,實驗組和對照蛋白組ICOSL表達無明顯差異。 第三部分,研究表明PD-L2的抗體可以向成熟DCs傳遞逆向信號,而我們及其他研究者均發(fā)現(xiàn)DCs成熟過程當中,ICOSL的表達量逐漸下調。

10、那么ICOS能否向成熟過程中和成熟后的DCs傳遞逆向信號調節(jié)DCs的功能狀態(tài)?我們在ICOSIg處理DCs的同時加入100ng/mL LPS或者是在加入100ng/mL LPS處理24h誘導DCs成熟后,再用ICOSIg處理DC24 h。結果LPS單獨處理組DC分泌各種細胞細胞因子,除IL-2、IL-4,均比無LPS處理組明顯升高,其表面分子的表達也明顯增加,高于未刺激不成熟DCs。與對照組IgG相比,ICOSIg加LPS處理組DCs分

11、泌TGF-β1的表達明顯高于對照組,IL-10、IL-12 P40、IL-12 P70、TNF-α、IFN-γ等均無明顯差別。ICOSIg+LPS組DC細胞各表面分子的表達也低于或類似于對照組。 第四部分,為了進一步在體內(nèi)確證ICOSIg引起的DCs功能變化,我們采用皮膚過敏實驗研究ICOSIg作用后的DCs調節(jié)細胞免疫功能的變化。用ICOSIg處理DCs,再用p815AB多肽和5μM破傷風毒素(tetanus toxin,tt

12、)多肽沖擊后,經(jīng)尾靜脈輸入不同分組小鼠。2周后,誘發(fā)過敏反應。結果表明：(1)無處理和對照IgG1蛋白處理不成熟DCs體外經(jīng)p815AB和tt刺激后,能引起輕度足墊皮膚過敏反應；而經(jīng)過ICOSIg處理后,DCs能夠誘發(fā)出明顯的過敏反應,實驗鼠左足重量明顯增加；(2)若ICOSIg處理DCs細胞前先用足量抗ICOSL抗體封閉,則ICOSIg處理足墊過敏反應程度顯著下調；(3)若在DCs與ICOSIg或IgG1孵育時加入抗IL-6阻斷性抗體

13、,則ICOSIg處理也不能引起典型足墊過敏反應。如在ICOSIg處理DCs的同時,加入LPS刺激,再進行體內(nèi)實驗,則各實驗組DCs細胞均可誘發(fā)出明顯的過敏反應,但對照與實驗組之間無明顯差異。抑制DCs中p38-MAPK通路進而抑制IL-6的分泌后,DCs誘導皮膚過敏反應的能力下調。 討論： 共刺激分子家族成員配受體之間存在正反向信號的現(xiàn)象比較普遍。我們在本課題中致力于研究ICOS/ICOSL通路是否同樣存在反向信號,并對

14、該信號的性質作深入的探討。以往研究用計算機模擬的方式,證明人和小鼠的ICOS結構相似,ICOS與配體ICOSL結合面關鍵氨基酸的序列也高度相似；我們的研究表明真核表達的人ICOSIg確實可以和小鼠DCs細胞表面ICOSL發(fā)生特異性結合,并具有生物學活性。進一步研究表明可溶性ICOSIg可以向不成熟DC傳遞逆向信號,引起骨髓來源不成熟DCs特異性分泌IL-6增加,同時DCs表型分子CD83、CD80、CD86和Iab表達均高于相應對照組。

15、ICOS處理不成熟DCs后其吞噬和抗原遞呈功能均增強,引起Th1細胞比例和功能增加,可在體內(nèi)促進DCs調節(jié)的細胞免疫。然而,我們也發(fā)現(xiàn)如果在ICOSIg作用DCs過程中加入LPS或CpG誘導DCs成熟,則DCs分泌TGF-β1升高。由于LPS等因素刺激DCs成熟后,DCs分泌大量的促炎細胞因子如IL-6、IL-12、TNFα、IL-1β等,因此,盡管ICOS可以引起TGF-β1的部分增加,但其抑制免疫反應的功能作用有限,在體外僅引起DC

16、s部分功能的改變,在體內(nèi)則不能檢測到明顯的功能差異。然而也存在另外一種可能,因為ICOS僅在DCs成熟過程中促進其表達TGF-β1,而我們是在使用LPS和ICOSIg作用完畢后,收集細胞輸注小鼠體內(nèi),此時,細胞已基本處于成熟狀態(tài),不同實驗處理引起的DCs功能差異己接近消失,在這種情況下,皮膚過敏反應的模型可能并不能夠真實反應DCs功能的改變,可能需要更好的模型來檢測相關的功能變化。 通過本課題的研究,我們首次證明和其他部分共刺激

17、分子一樣,ICOS/ICOSL通路也存在反向信號；然而不同的是,隨著環(huán)境因素的不同,ICOS可以通過同樣的配體ICOSL傳遞不同的免疫信號：向不成熟DCs傳遞免疫刺激信號,誘導IL-6產(chǎn)生,增強機體的免疫反應；向成熟過程中的DCs傳遞免疫抑制信號,誘導TGF-β1表達,調節(jié)成熟過程中DCs細胞的功能狀態(tài)。以往研究表明同一個配體可以通過不同受體傳遞不同信號,如PD-1通過其配體PD-L1和PD-L2可傳遞不同的信號；不同的配體也可以經(jīng)過同

18、一個受體傳遞不同的信號,如CCL19和CCL21結合CCR7、CD28/CTLA-4結合CD80/CD86;然而,像ICOS/ICOSL這種同一個配體通過同一個受體傳遞不同信號的方式卻是首次證實,這也更表明免疫系統(tǒng)、免疫細胞之間相互影響、相互調控網(wǎng)絡的復雜性。因此,ICOS可以通過DCs表面的ICOSL向不同成熟狀態(tài)的DCs傳遞不同的信號,調節(jié)機體在不同狀態(tài)下的免疫應答,這為進一步闡明ICOS/ICOSL通路在機體免疫調控中的作用以及針