微球培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為髓核樣軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、椎間盤退變是一類嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的常見病，為腰背痛主要原因之一，其退變主要是由于椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞減少和細(xì)胞外基質(zhì)成份的改變。近年椎間盤組織工程研究中，利用種子細(xì)胞移植修復(fù)組織損害和促進(jìn)功能恢復(fù)作用的治療方法成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最引人關(guān)注的熱點(diǎn)之一。在諸多種子細(xì)胞的研究中，脂肪組織中的脂肪干細(xì)胞具有含量多、位置表淺易取材及增殖能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有多分化潛能的成體干細(xì)胞，很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為髓核樣軟骨細(xì)胞。細(xì)胞的微

2、球培養(yǎng)技術(shù)在組織工程中應(yīng)用表明，在細(xì)胞微球的中心由于缺氧和低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，這與體內(nèi)的髓核細(xì)胞的生存環(huán)境相類似，更利于種子細(xì)胞向髓核樣軟骨細(xì)胞分化?；谡T導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣軟骨細(xì)胞分化的各項(xiàng)研究，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)和細(xì)胞因子兩種誘導(dǎo)方式做比較，探索體外細(xì)胞誘導(dǎo)分化的最佳方法，為今后種子細(xì)胞移植治療椎間盤退變性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.取新西蘭大白兔腹股溝、腋下脂肪，0.3％的Ⅱ型膠元酶膠原酶溶液中

3、下剪碎并消化40min(37)℃，所得的消化液過(guò)濾、離心獲取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。取新西蘭大白兔整段脊柱，切開纖維環(huán)取髓核組織，0.3％的Ⅱ型膠元酶膠原酶溶液中下剪碎并消化30min(37)℃，所得的消化液過(guò)濾、離心獲取髓核細(xì)胞。所收集的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞用DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液分別單層培養(yǎng)。
　　2.脂肪干間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至3代經(jīng)鑒定后，按5×106個(gè)髓核細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別置于Eppendorf管中離心，培

4、養(yǎng)3-4天制成細(xì)胞微球。
　　3.將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞微球置于Transwell下層培養(yǎng)，分別通過(guò)5×106個(gè)髓核細(xì)胞微球及TGF-β1/IGF-1誘導(dǎo)；于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)7、14天，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并通過(guò)RT-PCR對(duì)Ⅱ型膠原、蛋白多糖含量進(jìn)行測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　在體外誘導(dǎo)7、14天，兩組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞微團(tuán)體積、形態(tài)無(wú)明區(qū)別，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示7天TGF-β1/IGF-1組與髓核誘導(dǎo)組均有Ⅱ型膠原及蛋白多糖m

5、RNA表達(dá)，但TGF-β1/IGF-1組表達(dá)更強(qiáng)；誘導(dǎo)14天髓核誘導(dǎo)組Ⅱ型膠原及蛋白多糖mRNA表達(dá)明顯增高，優(yōu)于但TGF-β1/IGF-1組。
　　結(jié)論：
　　在體外NPCs和TGF-β1/IGF-1對(duì)ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)均有促進(jìn)其向NPCs分化作用，而TGF-β1、IGF-1為正常髓核細(xì)胞分泌重要因子，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明NPCs對(duì)ADSCs的誘導(dǎo)之間除細(xì)胞因子作用外，尚存在相互促進(jìn)增殖分化作用，為更好向髓核樣細(xì)胞分化仍其它誘導(dǎo)