S100A4基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的： 胃癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展乃至侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因改變、多因素參與的多步驟復(fù)雜過程，雖然進(jìn)行了大量研究，但其分子機(jī)制還遠(yuǎn)不清楚。S100A4是Ca<'+>結(jié)合蛋白S100家族的成員之一，研究表明它降低腫瘤細(xì)胞間黏附能力、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)水解和重塑、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動能力、促進(jìn)血管生成，在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用<'[1-5]>。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了S100A4基因與胃癌浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌細(xì)胞體外侵襲力等特性密切相關(guān)

2、，但是S100A4基因在胃癌中的作用及表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此我們采用RNA干涉技術(shù)抑制BGC823細(xì)胞中S100A4基因表達(dá)，分析細(xì)胞凋亡、增殖等改變及其分子機(jī)制。近年來腫瘤的微環(huán)境與其侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系倍受關(guān)注，尤其是腫瘤微環(huán)境低氧，低氧增加基因組不穩(wěn)定性及基因組異質(zhì)性并通過表觀遺傳方式調(diào)控基因表達(dá)。我們前期應(yīng)用生物信息學(xué)方法在S100A4基因內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了HIF-1反應(yīng)元件的核心序列，推測研究微環(huán)境低氧可能上調(diào)S100A4基因表達(dá)。

3、因此本課題將對胃癌細(xì)胞BGC823進(jìn)行低氧處理，觀察其對S100A4基因表達(dá)的影響。對上述問題的研究不僅有助于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，而且對胃癌診斷、治療也將具有重要指導(dǎo)意義。 材料與方法： 1、實(shí)驗(yàn)材料：胃癌細(xì)胞系BGC823、pSilencerTM 4.1-CMV neo vector表達(dá)載體、RPMT1640培養(yǎng)基、TRIZOL Reagent、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑

4、盒、JM109感受態(tài)細(xì)胞、S100A4/NF-γ B抗體。 2、實(shí)驗(yàn)方法： (1)細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO<,2>，實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。 (2)針對S100A4基因設(shè)計(jì)siRNA，采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建S100A4特異性shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，RT-PCR、W