人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及生物學(xué)特性探討.pdf

1、目的：在體外將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)進(jìn)行純化、擴(kuò)增及向心肌樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行心肌樣細(xì)胞相關(guān)特性分析并探討體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)向心肌樣細(xì)胞分化過程中分化與凋亡的情況，檢測(cè)分化過程中心肌細(xì)胞特征表達(dá)及膜電位變化的情況，為hMSCs臨床移植治療提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。 方法：(1)采用體外純化、擴(kuò)增后的第4代hMSCs在體外經(jīng)5μmol．l<'-1>5-雜氮胞苷誘導(dǎo)24小時(shí)后繼續(xù)培養(yǎng) 8 周

2、，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，免疫組化方法鑒定心肌特異性蛋白心房鈉尿肽(ANP)和連接蛋白(CX43)的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面抗原(CD31、CD34、CD45、CD90)的表達(dá)情況，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期細(xì)胞膜電位的變化。 (2)將純化、擴(kuò)增后的第 4 代hMSCs，分3組在體外分別經(jīng)0 μmol．l<'-1>、2.5 μmol．l<'-1>、5.0μmol．l<'-1> 5-azacytidine(5-

3、Aza)誘導(dǎo)24h后繼續(xù)培養(yǎng)8周，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形念變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期及凋亡指數(shù)，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析肌球蛋白重鏈(β-MHC)、肌鈣蛋白T(CTNT)、凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax)的mRNA在分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 結(jié)果：hMSCs誘導(dǎo)前為紡錘形，誘導(dǎo)后第2天部分細(xì)胞即開始發(fā)生形變，呈球形或短棒狀，1周后胞漿中顆粒增多，約20～30％細(xì)胞邊緣呈毛刷樣變化；hMSCs表面抗原CD31、CD34、CD

4、45在誘導(dǎo)前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD90未誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)呈弱陽性，誘導(dǎo)后明顯增高(P<0.05)；ANP和CX43在誘導(dǎo)前無表達(dá)，誘導(dǎo)后第2周開始表達(dá)且表達(dá)隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，但CX43在誘導(dǎo)后第5周表達(dá)量開始降低。hMSCs誘導(dǎo)后凋亡指數(shù)隨誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間增加，低濃度誘導(dǎo)組低于標(biāo)準(zhǔn)濃度誘導(dǎo)組，組問差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例誘導(dǎo)后較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)；β-MHC和CTNT基因分別在誘導(dǎo)后第1周和

5、第4周時(shí)表達(dá)開始增強(qiáng)，在第6周時(shí)均達(dá)到高峰，第8周時(shí)表達(dá)開始衰減，Bcl-2、Bax基因表達(dá)呈時(shí)間依賴性變化，hMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后隨心肌樣細(xì)胞特征的表達(dá)膜靜息電位、去極化幅值和去極化速率逐漸增高。 結(jié)論：(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)純化、擴(kuò)增和誘導(dǎo)后可表現(xiàn)心肌樣細(xì)胞的生物學(xué)特性，可為hMSCs臨床移植治療提供可靠的細(xì)胞來源；(2)體外誘導(dǎo)過程中hMSCs可發(fā)生細(xì)胞凋亡，采用2.5 μmol．l<'-1>5-Aza低濃度誘導(dǎo)可減少