NO對仔豬支持細(xì)胞骨架的影響及機(jī)制研究.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種具有保護(hù)與殺傷雙重生理功能的信號分子，它對于雄性生殖也具有雙重調(diào)節(jié)作用。睪丸支持細(xì)胞(sertoli cell，SC)骨架結(jié)構(gòu)的完整是維持精子生成的前提和基礎(chǔ)。許多藥物進(jìn)入睪丸內(nèi)都有可能會產(chǎn)生過量NO，而睪丸中的SC最易受到這些藥物的影響。研究NO對SC骨架的影響及機(jī)制，不僅可以進(jìn)一步認(rèn)識精子生成的調(diào)節(jié)機(jī)制，豐富和完善雄性性腺的發(fā)育生物學(xué)機(jī)制，同時也可為治療雄性不育奠定基礎(chǔ)，還可以為藥物的

2、安全性評價提供依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)以仔豬為研究對象，利用體外培養(yǎng)的SC，通過使用能產(chǎn)生NO的SNP處理細(xì)胞，模擬細(xì)胞內(nèi)的NO環(huán)境從而構(gòu)建合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察NO對SC骨架結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)鐵蛋白分泌的影響。同時，還檢測了SC內(nèi)抗氧化水平以及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的活性。 實(shí)驗(yàn)首先采用濃度分別為1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L和1mmol/L的SNP處理SC24h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著SNP濃度的增加，SC

3、內(nèi)NO水平顯著升高。NO水平在0.07±0.01～2.74±0.03μmol/L之間變化，不僅涵蓋了正常的生理濃度，而且也包括了高于1μmol/L的濃度范圍，同時排除了內(nèi)源性的NO對本實(shí)驗(yàn)的影響。此外，實(shí)驗(yàn)還檢測了不同濃度SNP處理SC24h對SC活力的影響，結(jié)果顯示1μmol/LSNP組細(xì)胞活力較對照組上升了15.90％，差異顯著(P＜0.05)；當(dāng)SNP濃度為10μmol/L、100μmol/L和1mmol/L時，細(xì)胞活力較對照組分

4、別下降了2.55％、12.36％和59.89％，其中100μmol/L和1mmol/LSNP組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。 SC體外培養(yǎng)24h后，加入含1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L和1μmmol/LSNP的培養(yǎng)液，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取和蛋白定量分析。經(jīng)westernblot檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度NO能提高SC內(nèi)p38絲裂原活化蛋白激酶(D38MAPK)的活性，1μmol/L、10μmol

5、/L、100μmol/L和1mmol/LSNP組p38MAPK的活性較對照組分別上升了15.38％、16.92％、36.92％和69.23％，差異顯著(P＜0.05)。 接著在體外培養(yǎng)24h的SC中加入1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1mmol/LSNP和1mmol/LSNP+20μmol/LSB203580(SB203580提前30min加入)的培養(yǎng)液，通過細(xì)胞免疫熒光檢測，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1μmol/L、10μ

6、mol/L、100μmol/LSNP和1mmol/LSNP+20μmol/LSB203580組細(xì)胞骨架中細(xì)而密集的微絲較為均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)中，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰，較對照組無明顯差異；而1mmol/LSNP組細(xì)胞內(nèi)的微絲應(yīng)力纖維網(wǎng)和微絲束被破壞，出現(xiàn)微絲邊集化。同時，1μmol/L、10μmol/L和100μmol/LSNP組細(xì)胞骨架中α—tubulin呈放射狀排列在核外，較對照組無明顯差異；而1mmol/LSNP組細(xì)胞內(nèi)的微管網(wǎng)完全損壞，呈

7、彌散形。 此外，隨著SNP濃度升高，轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量呈下降的趨勢，1μmol/L和10μmol/LSNP組細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量與對照相比差異不顯著(P＞0.05)。當(dāng)SNP濃度為100μmol/L和1mmol/L時，細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量較對照組分別下降了15.79％和25.26％，差異顯著(P＜0.05)。當(dāng)細(xì)胞中同時加入1mmol/LSNP和SB203580時，細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白分泌量較僅加入1mmol/LSNP相比顯著上升了30.99

8、％(P＜0.05)。這表明NO在破壞細(xì)胞骨架的同時，也降低了細(xì)胞的分泌功能。與此同時，高濃度NO使SOD、GSH和T—AOC等水平顯著下降，并激活了p38MAPK途徑。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)可以得到如下結(jié)論： (1)本實(shí)驗(yàn)建立的細(xì)胞模型適用于研究NO對SC功能的影響； (2)低濃度的NO能保證細(xì)胞的存活，而高濃度的NO對細(xì)胞的存活和功能有損傷； (3)SNP處理使SC內(nèi)NO的水平升高，降低了細(xì)胞抗氧化能力；并