細胞骨架破壞對體外培養(yǎng)兔軟骨細胞基質(zhì)代謝分泌的影響.pdf

1、研究背景：隨著老齡化進程加快和體育運動普及，骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthrit is，OA）、關(guān)節(jié)軟骨損傷等軟骨細胞相關(guān)疾病逐年增加。有大量的研究表明細胞骨架（cytoskeleton，CSK）在軟骨退變及OA 發(fā)生的過程有著明顯改變。本課題目的就在于探討細胞骨架的三種成分在軟骨細胞基質(zhì)代謝中的作用，進而揭示骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞退變發(fā)病機理。同時可以應(yīng)用某些調(diào)節(jié)細胞骨架成分降解的手段來干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的負(fù)面作用，為骨性關(guān)節(jié)炎的治

2、療開辟新的途徑。
　　 目的：利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser confocAlscanning microscope，LCSM）觀察軟骨細胞CSK 形態(tài)，并對軟骨細胞CSK蛋白熒光強度進行定量測定，觀察正常與加入三種細胞骨架破壞劑的軟骨細胞CSK 形態(tài)及蛋白量以確定CSK 破壞是否有效。在明確了細胞骨架微絲、微管和中間纖維三種成分被相應(yīng)的細胞骨架破壞劑破壞以后分析微絲、微管和中間纖維三種細胞骨架（cytoskeleton，

3、CSK）成分破壞對體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝（Ⅱ型膠原和糖胺多糖）的影響。
　　 方法：取2月齡新西蘭大白兔10只，取雙膝關(guān)節(jié)軟骨行軟骨細胞培養(yǎng)，待細胞貼壁后，隨機分為四組，即正常對照組、微絲破壞組（加入0.01mg/L細胞松弛素-D 破壞肌動蛋白）、微管破壞組（加入0.4mg/L 秋水仙素破壞微管蛋白）、中間纖維破壞組（加入175mg/L丙烯酰胺破壞波形蛋白）。培養(yǎng)3天后，各組取部分細胞消化并爬片，行免疫熒光染色及共聚焦顯微

4、鏡熒光值半定量檢測。觀察各組細胞微絲蛋白、微管蛋白和波形蛋白的形態(tài)及含量變化。并于培養(yǎng)第3、6、9天取各組細胞上清液，用ELISA 法和阿爾新藍法檢測各組上清液中Ⅱ型膠原和糖胺多糖（proteoglycan，GAG）的含量。
　　 結(jié)果：軟骨細胞微絲呈絲狀，分布在細胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，沿細胞外圍輪廓排列，微絲破壞后可見微絲細胞外圍的增亮固體環(huán)減弱。微管在核周呈放射狀散向整個細胞，微管破壞組可見微管解聚，蛋白結(jié)構(gòu)稀疏。波形蛋白呈細絲狀，

5、形成相互交織的貫穿胞質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，中間纖維破壞組可見細胞變圓，蛋白熒光減低。對三種骨架蛋白成分的平均熒光值進行相應(yīng)的分析，可見相應(yīng)CSK 破壞組熒光值與對照組相比均明顯降低（p<0.05）。同時，微管破壞組和中間纖維破壞組在第3、6、9天上清液中的Ⅱ型膠原和GAG 含量均明顯低于對照組（p<0.05），而微絲破壞組與對照組在第3、6、9天上清液中的Ⅱ型膠原和GAG含量均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：預(yù)設(shè)濃度的CSK 破壞劑可以破壞