亞磷酸脫氫酶的體外定向進(jìn)化及其固定化研究.pdf

1、亞磷酸脫氫酶(EC1.20.1.1)，將底物亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽，同時(shí)將催化反應(yīng)所必須的氧化型煙酰胺輔酶(NAD+)還原為還原型煙酰胺輔酶(NADH)。該酶能夠代謝利用低價(jià)態(tài)亞磷酸鹽，同時(shí)產(chǎn)物伴隨有還原型煙酰胺輔酶的生成，這兩大特點(diǎn)使得亞磷酸脫氫酶在轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)研究領(lǐng)域和工業(yè)生物催化的輔酶再生領(lǐng)域都有著巨大的應(yīng)用潛能和廣闊的發(fā)展空間。
　　本研究以羅爾斯通菌屬(Ralstonia sp.strain4506)中的亞磷酸脫氫酶基因

2、為基礎(chǔ)，通過人工密碼優(yōu)化合成，在大腸桿菌中克隆表達(dá)。亞磷酸脫氫酶基因(ptxD)全長1011bp，共編碼336個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量大小為36.7kDa。酶學(xué)性質(zhì)分析表明最適溫度為45℃，最適pH為7.0。在40℃和45℃下處理100min，仍保持催化活性，但在50℃處理20min活性幾乎完全喪失。在pH4.5-9.5范圍內(nèi)活性相對穩(wěn)定，均保持在80％以上。該酶對亞磷酸鹽的Km和kcat值分別為9.35±0.37mM和157.48±1

3、.99min-1，催化效率(kcat/Km)為16.85mM-1·min-1;對NAD+的Km和kcat值分別為0.53±0.02mM和190.24±2.09min-1，催化效率(kcat/Km)為353.02mM-1·min-1。
　　為提高亞磷酸脫氫酶的催化活性，通過定向進(jìn)化技術(shù)在約10000個(gè)突變株中篩選得到一株催化活性有所提高的突變株P(guān)TDH-M20，該突變株與野生型氨基酸序列相比，第139位的酪氨酸被色氨酸替代，最適溫度

4、和pH均與野生型保持一致，突變株P(guān)TDH-M20對亞磷酸鹽的Km和kcat值分別為6.52±0.34mM和459.10±6.29min-1，催化效率（kcat/ Km）為70.46mM·min-1;對NAD+的Km和kcat值分別為0.97±0.04mM和501.23±7.97min-1，對NAD+催化效率分別為（kcat/Km）為514.71mM-1·min-1。突變株對亞磷酸鹽的親和力比野生型提高30％，催化效率比野生型提高近3倍，

5、對NAD+的親和力下降了83％，但催化效率仍然提升了45.8％。為進(jìn)一步研究139位點(diǎn)對于該酶催化活性的影響和作用，引入其他18種氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變研究。只有當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼?、谷氨酰胺、亮氨酸、蛋氨酸和精氨酸時(shí)突變株才具有催化活性，突變?yōu)槠渌?3種氨基酸后突變體均失活。在上述5株突變體中，PTDH-Y139F和PTDH-Y139Q的活性變化最為明顯，對亞磷酸鹽PTDH-Y139F和PTDH-Y139Q的催化效率分別是野生型的5

6、.19倍和5.83倍。對NAD+而言，PTDH-Y139F和PTDH-Y139Q的催化效率分別是野生型的2.74倍和2.89倍。該結(jié)果為該酶的結(jié)構(gòu)功能研究提供重要信息，也為該酶在工業(yè)和轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　以Fe3O4磁性納米顆粒作為載體結(jié)合交聯(lián)聚集體(CLEAs)的固定化方法對亞磷酸脫氫酶進(jìn)行固定化研究。固定化酶Fe3O4-PTDH的最適溫度為50℃，比游離態(tài)PTDH提高5℃，最適pH為6.5。在50℃下處理10