水產(chǎn)品主要過敏原快速定量檢測及過敏原性研究.pdf

1、甲殼類和魚類是消費(fèi)者喜愛的水產(chǎn)品，但是國內(nèi)外甲殼類過敏和魚過敏現(xiàn)狀均不容樂觀，對(duì)消費(fèi)者的健康和生活水平造成了一定程度的傷害。原肌球蛋白和精氨酸激酶是甲殼類兩個(gè)主要的過敏原，而小清蛋白和Ⅰ型膠原蛋白是魚類的主要的過敏原。食物過敏原檢測一般采用ELISA和PCR分析。但這兩種方法檢測過程復(fù)雜繁瑣、檢測時(shí)間長，易造成假陽性，在過敏原檢測方面有其局限性。雖然早在2001年，Ⅰ型膠原蛋白已被證實(shí)有較強(qiáng)的過敏原性，但其抗原性的消減以及線性表位的研究

2、至今比較匱乏。針對(duì)以上問題，本文建立了一種能簡便、快速、準(zhǔn)確同時(shí)檢測甲殼類兩個(gè)主要過敏原的方法，探討了超高壓和酶解對(duì)魚過敏原Ⅰ型膠原蛋白抗原性的影響。本文還對(duì)虹鱒魚過敏原Ⅰ型膠原蛋白的線性表位進(jìn)行了預(yù)測和驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:
　　(1)建立離子交換層析與動(dòng)態(tài)涂層毛細(xì)管電泳結(jié)合的方法同時(shí)檢測甲殼類的兩個(gè)主要過敏原——原肌球蛋白和精氨酸激酶。首先，離子交換層析富集了粗提物中的原肌球蛋白和精氨酸激酶。之后，本文優(yōu)化了毛細(xì)管電泳分離條件，

3、得到最佳分離條件為:分離電壓18kV，含0.3％Tween-20的30mM，pH9.0硼酸-硼砂緩沖液作為運(yùn)行緩沖液。在該分離條件下能在5.5min內(nèi)同時(shí)準(zhǔn)確檢測甲殼類的原肌球蛋白和精氨酸激酶。并經(jīng)方法學(xué)考察得到原肌球蛋白和精氨酸激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.1104x+0.2018和y=0.1016x+0.1123，R2分別為0.9964和0.9985，線性范圍均為5-100μg/mL，檢測限分別為1.1μg/mL和1.2μg/mL，定量

4、限分別為3.7μg/mL和4.0μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜10％，回收率分別為94.0％-109.5％和91.5％-106.1％，表明了該方法的準(zhǔn)確可靠性。
　　(2)采用超高壓技術(shù)和酶解技術(shù)對(duì)虹鱒魚過敏原Ⅰ型膠原蛋白的抗原性進(jìn)行消減。通過比較超高壓處理前后Ⅰ型膠原蛋白的抗原性的強(qiáng)弱，發(fā)現(xiàn)200MPa，25℃，超高壓處理10min時(shí)，Ⅰ型膠原蛋白抗原性最弱，降低了42.66％。通過比較木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶酶以及胰蛋白酶酶解前

5、后Ⅰ型膠原蛋白的抗原性的強(qiáng)弱，得到最佳酶解條件為胰蛋白酶在37℃，pH8.0，E∶S為1∶10，Ⅰ型膠原蛋白抗原性消減97.69％。
　　(3)采用DNAStar軟件分別對(duì)虹鱒魚過敏原Ⅰ型膠原蛋白的α1、α2亞基的親疏水性、可塑性、可及性、抗原指數(shù)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并結(jié)合Bepipred、ABCpred、BCPRED等在線工具預(yù)測分別得到10條α1、α2亞基的表位多肽。MegAlign軟件分別分析虹鱒魚過敏原Ⅰ型膠原蛋白的α1