小鼠甲狀腺來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：
　　探索小鼠甲狀腺來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，比較其與骨實(shí)質(zhì)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有差異，為臨床研究自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用組織貼壁培養(yǎng)法，體外無(wú)菌分離并培養(yǎng)C57BL/6小鼠甲狀腺來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（Thyroid derived Mesenchymal Stem Cells，TMSCs），以小鼠骨實(shí)質(zhì)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（Boneessence derivedM

2、esenchymalStemCells, BMSCs）作對(duì)照，通過(guò)倒置顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)，然后利用不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)貼壁細(xì)胞向成脂肪、成骨分化，油紅O染色檢測(cè)成脂分化能力，堿性磷酸酶及Von Kossa染色檢測(cè)成骨分化能力，Q-PCR檢測(cè)相關(guān)成脂肪和成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。進(jìn)一步，采用 CCK8法檢測(cè)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型和細(xì)胞周期。
　　2、在獲得小鼠甲狀腺來(lái)源 MSCs的基礎(chǔ)上，采用淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（Lym

3、phocyte transformation test，LTT)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)檢測(cè)MSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的免疫抑制功能。進(jìn)一步，將甲狀腺來(lái)源 MSCs與 DC共培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察 DC形態(tài)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面抗原的表達(dá)，Q-PCR法在 mRNA水平檢測(cè)促炎因子 IFN-γ、TNF-α和IL-12的表達(dá)水平。
　　3、建立異體鼠尾皮瓣移植模型，檢測(cè)甲狀腺來(lái)源

4、MSCs體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)及修復(fù)受損組織的能力。將小鼠甲狀腺來(lái)源 MSCs通過(guò)尾靜脈輸注模型小鼠體內(nèi)，每日觀察移植皮瓣炎癥反應(yīng)程度和愈合情況，第7天行病理學(xué)檢測(cè)移植皮瓣組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度。
　　結(jié)果：
　　1、從小鼠甲狀腺和骨實(shí)質(zhì)組織中均可培養(yǎng)出貼壁生長(zhǎng)的成纖維樣的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞表型，兩種細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD140、CD105和Sca-1，而不表達(dá)CD34、CD45、CD31、CD11b和MHCII。進(jìn)一步

5、，將細(xì)胞向脂肪和骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示，細(xì)胞可被誘導(dǎo)成脂肪，油紅染色可見(jiàn)有大量脂滴出現(xiàn)，Q-PCR檢測(cè)可見(jiàn)脂肪分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá)；成骨誘導(dǎo)分化后，堿性磷酸酶染色可見(jiàn)堿性磷酸酶活性增高，Von Kossa染色可見(jiàn)鈣化骨結(jié)節(jié)形成，Q-PCR檢測(cè)可見(jiàn)成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RunX2和Osteocalcin的表達(dá)，說(shuō)明成功獲得小鼠甲狀腺來(lái)源MSCs。利用CCK8法檢測(cè)甲狀腺來(lái)源MSCs的生長(zhǎng)特性，結(jié)果顯示，細(xì)胞呈S型曲線

6、生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，可見(jiàn)80％以上細(xì)胞分布在G0/G1期,提示獲得的貼壁細(xì)胞符合干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。
　　2、在獲得TMSCs的基礎(chǔ)上，針對(duì)MSCs獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行LLT和MLR檢測(cè)。LTT檢測(cè)TMSCs對(duì)ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明， TMSCs可有效抑制ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖能力，且隨著TMSCs量的增加，其抑制作用顯著增強(qiáng)(P＜0.05)；利用異體淋巴細(xì)胞刺激的MLR實(shí)驗(yàn)也得到相同的實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)果，即MSCs抑制異體淋巴細(xì)胞抗原刺激的T細(xì)胞增殖能力隨著MSCs數(shù)量的增加，其抑制作用顯著增強(qiáng)(P＜.05)。
　　3、DC作為抗原遞呈細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)MSCs對(duì)DC功能也具有重要的調(diào)節(jié)作用。為此，我們?cè)隗w外利用MSCs與DC共培養(yǎng)體系，觀察甲狀腺來(lái)源MSCs對(duì)DC功能的影響，結(jié)果顯示，與甲狀腺來(lái)源MSCs共培養(yǎng)的DC，其形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞樹(shù)狀突起少而短；流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表面抗原表達(dá)，可見(jiàn)CD11c、C

8、D80、CD86和MHCII表達(dá)量均顯著下降；Q-PCR檢測(cè)相關(guān)促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-12 mRNA的表達(dá)亦顯著下降(P＜0.05)。
　　4、利用小鼠尾部皮瓣移植模型檢測(cè)甲狀腺來(lái)源 MSCs的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能和組織修復(fù)能力，結(jié)果表明，TMSCs與 BMSCs相似，具有修復(fù)鼠尾皮瓣損傷的能力，皮瓣損傷愈合較對(duì)照組快。病理切片結(jié)果顯示，TMSC治療小鼠皮瓣組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度較對(duì)照組低，提示TMSCs可有效促進(jìn)皮瓣損傷

9、愈合，減輕炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1、成功分離獲得小鼠甲狀腺來(lái)源MSCs，其細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、誘導(dǎo)分化能力和細(xì)胞增殖特性均與骨實(shí)質(zhì)來(lái)源MSCs相似。
　　2、通過(guò)體外LTT和MLR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠TMSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力，在體外可抑制 ConA和異種抗原刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖，且具有明顯的劑量依賴性。同時(shí)，TMSCs對(duì)抗原遞呈細(xì)胞DC的免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用，可顯著抑制DC的成熟。
　　3、體內(nèi)異體鼠尾