家兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的富集及生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的:建立從動員后家兔外周血分離、擴(kuò)增外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(PBMSCs)的方法，并就家兔PBMSCs表型特征、集落形成率及體外多向分化能力等生物學(xué)特性進(jìn)行研究評價，以確證家兔存在PBMSCs，并為外周血作為間充質(zhì)干細(xì)胞的新來源提供有價值的實驗依據(jù)。
　　 方法:①家兔PBMSCs的分離及表型鑒定:取成年新西蘭大白兔，按照30μg/kg給藥劑量皮下注射G-CSF動員6天，取兔外周血20 ml，采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離、培

2、養(yǎng)兔PBMSCs;取培養(yǎng)的P2代細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)(CD29、CD14)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色(CD90、CD105、CD44、CD34、CD45)對分離培養(yǎng)的兔PBMSCs進(jìn)行表型鑒定，實驗同時采用聚合酶鏈反應(yīng)(RT-P CR)對維持干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4的表達(dá)進(jìn)行檢測。②家兔PBMSCs生長曲線、細(xì)胞倍增時間(DT)及集落形成率(CFE)分析:取P2代細(xì)胞，以5×103/孔接種于24孔板，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)，從接種第2

3、d起每日消化3孔細(xì)胞，采用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，連續(xù)7d，繪制生長曲線，并計算細(xì)胞倍增時間。兔PBMSCs集落形成率的檢測:分別取未動員及動員后的兔外周血單個核細(xì)胞(PBMNCs)，按5×105/cm2接種于6孔板中，用含15％FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，14d后4％多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，置解剖鏡下觀察，對細(xì)胞數(shù)目超過50個的集落進(jìn)行計數(shù)。集落形成率

4、=集落形成單位數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)(×106)。③家兔PBMSCs向中胚層細(xì)胞分化能力鑒定:包括成骨、成軟骨和成脂分化能力。成骨誘導(dǎo)分化鑒定:取P2代細(xì)胞，以3.0×103/cm2密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)50％～60％時，棄去原培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組細(xì)胞換成2 ml/孔誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10％FBS、雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松）。置37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每3d換液1次，倒置顯微鏡觀察形態(tài)變化，

5、于誘導(dǎo)第21d進(jìn)行茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)分化情況。成軟骨分化能力鑒定:取P2代細(xì)胞，按5×105/mL細(xì)胞密度加入軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基（含VitC、ITS添加物、地塞米松、丙酮酸鈉、脯氨酸、TGF-β3）重懸細(xì)胞，吸取500μL細(xì)胞懸液（2.5×105個細(xì)胞）轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，150 g離心5 min，離心后小心地將離心管蓋擰松，置37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。每3d換液一次，觀察細(xì)胞團(tuán)塊變化，并于誘導(dǎo)21d后進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)塊的

6、石蠟包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色。成脂細(xì)胞分化能力鑒定:取P2代細(xì)胞，以2×104/cm2密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞長滿孔底時（培養(yǎng)2d左右），棄去原培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組換成2 mL/孔誘導(dǎo)培養(yǎng)液A（含10％FBS、雙抗、谷氨酰胺、胰島素、IBMX、吲哚美辛、地塞米松）培養(yǎng)3d，再換成維持培養(yǎng)液B（含10％FBS、雙抗、谷氨酰胺、胰島素）培養(yǎng)1d，構(gòu)成一個培養(yǎng)循環(huán)，同法培養(yǎng)三個循環(huán)后，用維持培養(yǎng)基B繼續(xù)培養(yǎng)7天，于誘導(dǎo)結(jié)束后

7、取出標(biāo)本進(jìn)行油紅染色。④家兔PBMSCs的跨胚層分化能力鑒定:包括神經(jīng)元樣細(xì)胞、肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定。含10％FBS、1μmol/L全反式維甲酸(ATRA)、2 mmol/L L-Glu的α-MEM培養(yǎng)基用于神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化;采用添加表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)預(yù)誘導(dǎo)2d后，再采用添加HGF、bFGF和尼克酰胺培養(yǎng)基誘導(dǎo)9d，最后用添加抑瘤素M、地塞米松和ITS液培養(yǎng)基誘導(dǎo)10d的分步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞分化。

8、采用免疫組化染色檢測神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)后的神經(jīng)元核蛋白(NeuN)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對肝樣細(xì)胞分化后的CK18的表達(dá)進(jìn)行檢測分析。
　　 結(jié)果:①家兔PBMSCs培養(yǎng)形態(tài):原代培養(yǎng)24 h后，可見較多短梭形及多角形貼壁細(xì)胞，3～4 d后出現(xiàn)集落樣生長，接種9～10 d融合度達(dá)80％以上;傳代培養(yǎng)的PBMSCs形態(tài)均一、呈長梭形漩渦狀生長。②家兔PBMSCs表型特征:FCM分析結(jié)果顯示PBMSC

9、s表達(dá)CD29，不表達(dá)CD14;免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，PBMSCs表達(dá)CD105、CD44、CD90及波形蛋白，不表達(dá)CD34和CD45。RT-PCR結(jié)果表明，PBMSCs表達(dá)多潛能干細(xì)胞特定轉(zhuǎn)錄因子OCT-4。③家兔PBMSCs生長曲線、細(xì)胞倍增時間及集落形成率:生長曲線顯示PBMSCs增殖能力旺盛，培養(yǎng)后2d進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞倍增時間為37.4 h;經(jīng)CFU-F集落形成率的實驗結(jié)果表明，動員后的家兔PBMSCs存在頻率為每百萬

10、個外周血單個核細(xì)胞(PBMNCs)中有2.8～10.8個PBMSCs，而未動員組僅為0～3個/106。④家兔PBMSCs的成骨、成軟骨和成脂分化能力:PBMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，茜素紅染色顯示有明顯的鈣結(jié)節(jié)形成;經(jīng)軟骨培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后21 d的細(xì)胞團(tuán)切片，阿利新藍(lán)染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng);經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，油紅染色顯示誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量脂滴。⑤家兔PBMSCs的跨胚層分化（神經(jīng)元樣細(xì)胞、肝樣細(xì)胞）能力:PBMSCs經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)

11、體系誘導(dǎo)后，出現(xiàn)NSE、NeuN表達(dá);經(jīng)肝樣細(xì)胞培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后可表達(dá)CK18。未誘導(dǎo)組均不表達(dá)上述分子。
　　 結(jié)論:成功從動員后家兔外周血中分離培養(yǎng)出高增殖能力的MSCs，即PBMSCs。在適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，家兔PBMSCs可向中胚層細(xì)胞（成骨、成軟骨、成脂細(xì)胞）分化;同時，本實驗還證實了分離培養(yǎng)的家兔PBMSCs具有向內(nèi)胚層（肝樣細(xì)胞）和外胚層（神經(jīng)元樣細(xì)胞）細(xì)胞跨系分化的潛力，提示外周血可以做為MSCs的新來源，PBM