人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、前言：
　　間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的成體干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。目前研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞不僅具有多向分化、支持體外造血重建的功能，還有低免疫原性和獨特的免疫調(diào)節(jié)特性?，F(xiàn)已證實，體外培養(yǎng)擴增的MSCs對各種免疫細胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，而且這種作用是不受MHC(majorhistocompatibility comple

2、x)限制的。低免疫原性在同種異體移植中具有重要意義，而免疫調(diào)節(jié)作用，則為免疫排斥反應(yīng)的治療帶來了新的希望。有研究表明，將MSCs與異基因造血干細胞(haemopoietie stem cell，HSC)共輸入，可以有效地減弱移植后的免疫排斥反應(yīng)。目前實驗及臨床研究所用的MSCs的主要來源是骨髓。另外，MSCs也可來源于脂肪、骨、肌肉、軟骨、肺臟、韌帶等。但由于數(shù)量有限，且對供者有一定的損傷，使其研究和應(yīng)用受到限制。為此，很有必要尋找新的

3、MSCs來源。
　　近年來有文獻報道，從胎兒出生后多作為廢物丟棄的胎盤中，可分離出一種成纖維細胞樣細胞，它可能含有與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)相似的特性。由于胎盤來源方便，對供者無損傷，且富含間充質(zhì)，如能分離出MSCs，將提供豐富的細胞來源。而目前，關(guān)于胎盤中是否含有豐富的間充質(zhì)干細胞以及該細胞是否具有BMSCs相似的免疫調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)的相關(guān)研究報道很少。

4、r>　　一直以來，免疫抑制藥物在免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防及治療中起著極為重要的作用。但是由于它們的毒副作用強，應(yīng)用有一定的限制性。能否利用MSCs的免疫調(diào)節(jié)特性，將MSCs與免疫抑制藥物聯(lián)合應(yīng)用于免疫排斥反應(yīng)的治療，在保證治療效果的前提下減少長期應(yīng)用藥物帶來的毒副作用，是個令人感興趣的問題。但是目前此類研究的報道很少。因此，在將它們聯(lián)合應(yīng)用于患者前，我們需要了解它們之間的相互作用。
　　本實驗嘗試從人胎盤中分離提取間充質(zhì)樣干細胞(hum

5、an placenta derivedmesenchymal-like stem cells PDMSCs)，對其細胞表型，增殖、分化等生物特性進行初步了解。并將人胎盤MSCs與異基因T淋巴細胞共培養(yǎng)，經(jīng)PHA刺激后，通過T細胞增殖的情況來測定PDMSCs對異基因T淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，進而通過檢測T細胞在細胞周期、早期活化標志、細胞因子的分泌、細胞亞群等方面的改變，來初步探討PDMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能機制。
　　我們還

6、將PDMSCs與免疫抑制藥物環(huán)孢素A(CsA)/霉酚酸(MPA)聯(lián)合，在體外作用于單向淋巴細胞混合反應(yīng)，通過檢測對淋巴細胞增殖情況的影響來初步判斷二者在異體免疫反應(yīng)中的相互作用。通過這些研究，我們期望能更加深入的了解胎盤來源間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性，為其在臨床上與免疫抑制藥物的聯(lián)合應(yīng)用，從而預(yù)防和治療免疫排斥反應(yīng)提供充足的實驗依據(jù)。
　　第一部分人胎盤來源間充質(zhì)千細胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性的研究
　　目的:從胎

7、盤中分離提取間充質(zhì)樣干細胞，并對其細胞表型、增殖、分化等生物特性進行初步了解。
　　方法:組織塊培養(yǎng)法進行PDMSCs的分離及原代培養(yǎng)，傳代后進行形態(tài)觀察，細胞計數(shù)法繪制PDMSCs的生長曲線，流式細胞技術(shù)檢測PDMSCs表型。PDMSCs向軟骨細胞及內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)，光鏡下觀察誘導(dǎo)后細胞形態(tài)，并用甲苯胺藍染色及免疫細胞化學(xué)染色法檢測向軟骨細胞誘導(dǎo)后糖胺多糖及Ⅱ型膠原的表達情況。免疫細胞化學(xué)染色法檢測向內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)后vWF的蛋白表達情

8、況。
　　結(jié)果:胎盤小塊培養(yǎng)14d后有少量長梭形細胞爬出，約25d鋪滿培養(yǎng)皿70-80％，細胞呈漩渦狀生長，胞體細長似成纖維細胞。傳代后增殖速度明顯加快，約6d可鋪滿培養(yǎng)皿底80％，細胞排列整齊，形態(tài)均一，連續(xù)15代后，細胞仍能維持增殖能力和典型的成纖維樣形態(tài)學(xué)特征。傳代細胞經(jīng)過約48h潛伏期后，進入一個3-5天的對數(shù)生長期，隨后是一個較長的緩慢增長期。平均倍增時間約為38h。經(jīng)流式細胞儀檢測PDMSCs均一表達CD29，CD44

9、，而不表達CD31，CD34,CD45，HLA-DR。PDMSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)7d后，由梭形逐漸向多角形多邊形轉(zhuǎn)變，并有多處凸起，誘導(dǎo)14d后，甲苯胺藍染色及免疫細胞化學(xué)染色均呈陽性。PDMSCs向內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)4d后，少量細胞核呈橢圓形，胞體變小呈卵圓形，形態(tài)飽滿，立體感強。第8d-12d，細胞60％-90％匯合，胞體變小呈鵝卵石樣。細胞首尾緊密連接，呈管腔狀、輪輻狀、條帶狀生長。誘導(dǎo)后4d胞漿和胞核開始表達vWF。
　　結(jié)論:

10、本研究成功地從人胎盤組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞PDMSCs，并證明PDMSCs有較強的增殖能力，具有與骨髓間充質(zhì)干細胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細胞表型，并可在一定條件下誘導(dǎo)表達軟骨細胞及內(nèi)皮細胞的標志，提示PDMSCs有多向分化潛能。
　　第二部分人胎盤間充質(zhì)干細胞對異基因T淋巴細胞增殖的影響及其機制的探討
　　目的:研究PDMSCs對共培養(yǎng)后異基因T淋巴細胞的影響，探討PDMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的方式及可能機制。
　　方

11、法:將PDMSCs與PHA激活的外周血T淋巴細胞共培養(yǎng)，MTT法檢測T細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測T細胞的周期，早期活化標志CD25、CD69的表達情況，AnnexinⅤ法檢測T淋巴細胞凋亡，ELISA法檢測T細胞分泌IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-4的水平，流式細胞術(shù)檢測T細胞中CD4+CD25+細胞的比例。
　　結(jié)果:PDMSCs對PHA激活的外周血T淋巴細胞的增殖有抑制作用，但對其凋亡無影響?？稍黾覶細胞中G0/G1

12、期細胞數(shù)量的比例，下調(diào)早期活化標志CD25、CD69的表達，增加T細胞分泌IL-10，IL-4的水平，降低T細胞分泌IFN-γ，IL-2的水平，上調(diào)CD4+CD25+T細胞在T淋巴細胞中的比例。
　　結(jié)論:PDMSCs在體外可抑制PHA刺激的T細胞的增殖，改變T細胞周期，抑制早期活化，改變T細胞亞群及細胞因子的分泌是其可能機制。PDMSCs具有免疫負調(diào)節(jié)作用，在移植免疫的預(yù)防及治療中可能具有重要意義。
　　第三部分人胎盤間充

13、質(zhì)干細胞與免疫抑制藥物在單向淋巴細胞混合反應(yīng)中的相互作用
　　目的:將PDMSCs與免疫抑制藥物聯(lián)合在體外作用于單向淋巴細胞混合反應(yīng)，來檢測它們在異體免疫反應(yīng)中的相互作用。
　　方法:PDMSCs單獨或與免疫抑制藥物（環(huán)孢素A/霉酚酸）同時在體外作用于單向淋巴細胞混合反應(yīng)，MTT法檢測T細胞的增殖情況。
　　結(jié)果:PDMSCs單獨在體外作用于單向淋巴細胞混合實驗，可抑制反應(yīng)中T細胞的增殖，且呈細胞數(shù)量依賴性。與環(huán)孢素A