骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和靶向燙傷創(chuàng)面愈合的研究.pdf

1、皮膚是阻止微生物、化學(xué)物質(zhì)等侵入以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的屏障，燒傷主要損害是皮膚壞死，大面積皮膚缺損可引起全身的改變。因而創(chuàng)面處理是燒傷救治的重要環(huán)節(jié)之一，大面積皮膚缺損創(chuàng)面的覆蓋與修復(fù)一直是臨床醫(yī)師倍感棘手的問題。燒傷創(chuàng)面的修復(fù)是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和遷移、膠原與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積以及再上皮化等。目前，燒傷創(chuàng)面修復(fù)方法主要是以局部治療為主。大面積深度燒傷患者由于自體皮源不足，多年來運(yùn)用網(wǎng)狀植皮、郵票植皮、小皮片移植

2、、微粒植皮等技術(shù)來擴(kuò)大皮膚覆蓋面積，取得了較好的臨床效果。但這些方法皮膚擴(kuò)增面積有限，難以滿足大面積皮膚缺損患者盡早封閉創(chuàng)面的需求，在加快創(chuàng)面愈合的速度和改進(jìn)創(chuàng)面愈合質(zhì)量，從而在減少功能障礙的發(fā)生率和提高患者生活質(zhì)量方面，目前常規(guī)應(yīng)用的這些方法顯然還存在著很多不足。 組織工程學(xué)的興起和發(fā)展，為臨床解決這一難題提供了嶄新的思路和途徑。組織工程將體外分離、培養(yǎng)的高濃度的功能相關(guān)的活細(xì)胞種植于天然的、人工合成的支架上，使之植入人體后能

3、夠形成新的有功能的組織，來制造、保存或修復(fù)失去的組織功能。組織工程化人體組織或器官產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵因素是植入足夠數(shù)量的、不引起免疫反應(yīng)的、具有再生活力的細(xì)胞。其中種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增成為組織工程學(xué)中的重要環(huán)節(jié)。理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有容易獲得，容易體外培養(yǎng)增殖，長期傳代不改變生物學(xué)特征，抗原性小，組織修復(fù)能力強(qiáng)等特征。目前，有關(guān)皮膚種子細(xì)胞的研究主要集中在表皮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和表皮干細(xì)胞研究，以及胚胎干細(xì)胞向表皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化等幾個(gè)方

4、面。表皮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)雖已有成功應(yīng)用的報(bào)道，但仍存在生產(chǎn)周期長、技術(shù)要求高和費(fèi)用昂貴等諸多限制：正常皮膚內(nèi)表皮干細(xì)胞數(shù)量有限，而大面積深度燒傷患者表皮干細(xì)胞來源更有限。同時(shí)表皮干細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)技術(shù)尚不夠成熟；在胚胎干細(xì)胞方面，牽涉到倫理、技術(shù)等諸多障礙。因此有必要探索一條新的途徑來克服皮膚種子細(xì)胞的技術(shù)難度和瓶頸問題。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，骨髓組織除含有造血干細(xì)胞外，還含有另一類干細(xì)胞——骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma

5、l stem cells，MSCs)。MSCs具有干細(xì)胞的共性，即自我更新及多向分化能力。大量研究證實(shí)，在一定誘導(dǎo)條件下MSCs可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化；同時(shí)MSCs還可以向外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓細(xì)胞分化。已有研究表明，把骨髓MSCs植入體內(nèi)，可向多種造血以外的組織如肺、骨、軟骨和皮膚等處定位并分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有無限增殖、多向分化的潛能，而且

6、還有明顯的可塑性，體內(nèi)移植后能遷移到病變部位并轉(zhuǎn)化為病變部位的細(xì)胞等特點(diǎn)。骨髓MSCs獲取簡便，簡單的骨髓穿刺即可獲得，體外培養(yǎng)條件不高，細(xì)胞分裂增殖快，MSCs可取自自體，不存在免疫排斥問題，即便是異體移植，由于骨髓MSCs屬于未分化的前體細(xì)胞，其細(xì)胞表型的分化尚不成熟，因而MSCs移植排斥反應(yīng)弱。而且MSCs體外基因轉(zhuǎn)染率高，故MSCs被認(rèn)為是良好的組織工程的種子細(xì)胞，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。由此可見MSCs有可能作為皮膚組織工程的

7、種子細(xì)胞，參與燒傷創(chuàng)面的愈合。Wistar大鼠是醫(yī)學(xué)研究中使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，本研究以Wistar大鼠為研究對(duì)象，比較分析不同條件下分離和培養(yǎng)的大鼠MSCs的生物學(xué)特性，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，以建立一種簡單、有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的分離、培養(yǎng)MSCs的方法。將綠色熒光蛋白基因通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MSCs，觀察其是否可應(yīng)用于組織工程修復(fù)技術(shù)的細(xì)胞標(biāo)記。 目的：應(yīng)用不同方法分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)化MSCs的分離方法，尋找一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)

8、用而又簡便的分離和培養(yǎng)MSCs的方法，為深入研究MSCs創(chuàng)造條件。 方法：分別采用全骨髓法(直接貼壁法)、Percoll分離液(密度為1.073g／ml)及淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077g／ml)梯度離心法分離MSCs，分別通過不同的首次換液時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，比較不同條件下分離和培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的底部所需時(shí)間及細(xì)胞生長特性、生長曲線和細(xì)胞貼壁率的差異，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和表面抗原CD44、CD90和CD45

9、的表達(dá)。 結(jié)果：采用全骨髓法分離的骨髓細(xì)胞，首次換液時(shí)間為72h、96h進(jìn)行培養(yǎng)后，獲得的細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞貼壁后增殖較為迅速，貼壁細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的底部所需時(shí)間均為6～7d，原代細(xì)胞純度不高，但傳代后，可獲得純度較高的MSCs；用密度為1.073g／ml的Percoll分離液分離的骨髓細(xì)胞，首次換液時(shí)間為48h、72h、96h進(jìn)行培養(yǎng)后，可獲得純度較高的MSCs，貼壁細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的底部所需時(shí)間為13～21d；而應(yīng)用密度為

10、1.077g／ml淋巴細(xì)胞分離液分離不能培養(yǎng)出梭形成纖維細(xì)胞樣貼壁生長的MSCs；首次換液時(shí)間過早很難獲得成纖維樣貼壁生長的MSCs。傳代后，細(xì)胞生長迅速，采用全骨髓法及Percoll分離液分離培養(yǎng)的細(xì)胞第1、2、3代之間生長曲線相似呈S型，在接種后的第1天、第2天為細(xì)胞的潛伏適應(yīng)期，從第3天起細(xì)胞開始增殖并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第6天左右細(xì)胞生長達(dá)頂點(diǎn)，以后進(jìn)人平臺(tái)期，第8天時(shí)細(xì)胞數(shù)量有所減少。計(jì)算群體倍增時(shí)間：采用直接貼壁法分離培養(yǎng)的第1

11、、2、3代骨髓MSCs分別為30.2h、29.6h和29.2h，Percoll分離法分離培養(yǎng)的骨髓MSCs群體倍增時(shí)間分別是為29.8h、29.3 h和29.0h。兩種方法分離培養(yǎng)的傳代細(xì)胞第1、2、3代之間的生長速度，經(jīng)方差分析P>0.05，還不能認(rèn)為2種方法培養(yǎng)的細(xì)胞第l、2、3代細(xì)胞間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：本研究建立了體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs的方法。應(yīng)用全骨髓法首次換液時(shí)間不少于72h，應(yīng)用密度為1.0

12、73g/ml的Percoll分離方法首次換液時(shí)間不少于48h，進(jìn)行培養(yǎng)可獲得成纖維樣貼壁生長的MSCs。Percoll分離法可以更好的提高M(jìn)SCs的純度，但培養(yǎng)周期較長；全骨髓法培養(yǎng)周期短，但純度較差，傳代后細(xì)胞純度得以提高。 第二部分 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其穩(wěn)定表達(dá)和影響 目的：檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)載體pEGFP-C1對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的轉(zhuǎn)染效率及其表達(dá)情況

13、和對(duì)細(xì)胞生長的影響。為利用pEGFP-C1轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供依據(jù)。 方法：pEGFP-C1質(zhì)粒經(jīng)體外擴(kuò)增、提取、純化后，經(jīng)酶切鑒定；以全骨髓法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取生長良好的第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染pEGFP，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率及熒光表達(dá)情況；通過G418篩選出抗性克隆，進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，觀察熒光持續(xù)時(shí)間并檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長曲線。 結(jié)果：綠色熒光蛋白在基因轉(zhuǎn)染24h后開始表達(dá)，pEG

14、FP轉(zhuǎn)染MSCs的效率為12％，經(jīng)過G418篩選后形成抗性克隆，表達(dá)持續(xù)4周以上，但熒光逐漸減弱。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞慢(P

15、治療皮膚深Ⅱ度燙傷的機(jī)制。 方法：以全骨髓法分離培養(yǎng)雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，消化、重懸后分別通過尾靜脈注射、創(chuàng)面局部注射移植給深Ⅱ度燙傷的雌性大鼠。觀察創(chuàng)面變化、肉芽組織生長和創(chuàng)面愈合情況；并在傷后不同時(shí)間點(diǎn)取組織標(biāo)本按常規(guī)方法作蘇木精-伊紅(HE)染色進(jìn)行組織學(xué)觀察；取活檢組織石蠟切片按免疫試劑盒S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測bFGF、PCNA，F(xiàn)AK、ERK和c-fos的表達(dá)情況。取不同時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)傷組織和骨髓組織，提取基因

16、組DNA，通過PCR方法檢測創(chuàng)面皮膚組織和骨髓中移植供體鼠的Y染色體基因性別決定區(qū)(Sry)片段的表達(dá)。 結(jié)果：燙傷大鼠創(chuàng)面愈合天數(shù)：靜脈注射組為20.5±1.92d，局部注射組為21.3±2.05d，對(duì)照組為24.6±2.67d。靜脈注射組和局部注射組愈合速度與對(duì)照組相比，差異均具有顯著性(PO.05)。HE染色結(jié)果：治療組創(chuàng)面愈合質(zhì)量均好于對(duì)照組。PCR檢

17、測結(jié)果表明，在治療組受體鼠的創(chuàng)面組織細(xì)胞有供體鼠Y染色體基因的表達(dá)；而且靜脈注射組骨髓組織中也檢測到了sry基因的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色顯示對(duì)照組燙傷后7d真皮深層血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA表達(dá)++，14d呈強(qiáng)陽性+++，到21d、28d表達(dá)有所下降為++。治療組PCNA表達(dá)與對(duì)照組無明顯差異；對(duì)照組燙傷后7d血管內(nèi)皮細(xì)胞FAK表達(dá)+，14d呈++，到21d、28d表達(dá)有所下降為+；靜脈注射組和局部注射組無明顯差異，燙傷后7d血管內(nèi)皮細(xì)胞FA