小鼠肥大細胞蛋白酶4、6的原核表達和多克隆抗體制備.pdf

1、在肥胖、糖尿病、粥樣動脈硬化和腹主動脈瘤等代謝疾病發(fā)病機制中，肥大細胞起著重要的作用。小鼠肥大細胞蛋白酶4、6（mMCP4、mMCP6）是小鼠肥大細胞特異蛋白酶，在肥大細胞相關疾病生物學中具有關鍵的調控作用。但是，市場上并沒有較好的商品化抗體，在一定程度上限制了這些肥大細胞蛋白酶細節(jié)作用機制的研究。因此，原核表達并制備這些蛋白酶的抗體，將有利于深入探討肥大細胞的相關作用機制。
　　本研究，構建了小鼠肥大細胞蛋白酶4(mMCP4)和

2、6(mMCP6)的原核表達體系，誘導表達并純化了包涵體蛋白，并通過多次皮下注射制備了兔抗mMCP4和兔抗mMCP6多克隆抗體。
　　其具體方法包括：(1)提取小鼠脾細胞總RNA，運用RT-PCR技術獲得目的基因mMCP4、mMCP6；(2)構建重組原核表達載體pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6，將其轉化到大腸桿菌BL21中，以異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導融合蛋白表達；(3)利用Ni親和層析柱純化mMCP4、m

3、MCP6融合蛋白；(4)純化后重組蛋白作為抗原免疫兔子獲得mMCP4多克隆抗體、mMCP6多克隆抗體；(5)采用ELISA法測抗體效價，westernblot測抗體特異性。
　　其具體結果表明：(1)經測序驗證，所擴增目的基因mMCP4、mMCP6序列準確，所構建重組表達質粒pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6成功；(2)經SDS-PAGE電泳驗證，所誘導并純化的mMCP4、mMCP6融合包涵體蛋白分子量符合預期，條