中華眼鏡蛇L-氨基酸氧化酶的分離純化及其體外抗腫瘤作用.pdf

1、L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase, LAAO）是蛇毒中的重要毒性成分，具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能，包括抗腫瘤活性。本文從中華眼鏡蛇毒中分離純化LAAO，鑒定其純度和理化性質(zhì)，并對(duì)其體外抗腫瘤作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制進(jìn)行研究，為其可能的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1.中華眼鏡蛇L-氨基酸氧化酶的純化與鑒定通過(guò)凝膠過(guò)濾、疏水層析和離子交換層析法從眼鏡蛇粗毒中分離LAAO 并鑒定其理化性質(zhì)，結(jié)果：①通過(guò)凝膠過(guò)

2、濾、疏水層析和離子交換層析法從眼鏡蛇粗毒中分離得到LAAO，每500mg 蛇毒中可純化得到6 mg LAAO，蛋白回收率1.2％，酶活力回收率43.3％，通過(guò)分子篩和RP-HPLC和SDS-PAGE 證實(shí)其是均一蛋白；②NA-LAAO 由兩個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基的分子量是55 kDa，全酶分子量120kDa；③通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列與眼鏡蛇L-氨基酸氧化酶cDNA 高度相符。
　　 2.眼鏡蛇L-氨基酸氧化酶

3、體外抗腫瘤細(xì)胞增殖作用及機(jī)制采用CCK-8 法測(cè)定NA-LAAO的細(xì)胞毒性及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響；
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot等方法分析NA-LAAO對(duì)ECV304細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。結(jié)果：①CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示，NA-LAAO對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈抑制作用，且呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。NA-LAAO 處理6 h、12 h、24 h對(duì)K562的半數(shù)抑制

4、濃度（IC50）分別為0.80、0.38和0.25 μg/ml；對(duì)ECV304為1.54、1.09和0.48 μg/ml；對(duì)MGC803為2.48、1.74和0.83 μg/ml；對(duì)U251為3.18、1.79和0.88 μg/ml；對(duì)A549為15.4、6.78和2.61μg/ml；不同細(xì)胞株對(duì)NA-LAAO的敏感性存在較大差異；②細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，0.156 μg/ml的NA-LAAO作用4天以后，可明顯抑制ECV304細(xì)胞增殖；0

5、.313 μg/ml的NA-LAAO 第2天起就有明顯效果；0.625 μg/ml的NA-LAAO 處理后，細(xì)胞多數(shù)死亡；③流式細(xì)胞術(shù)分析提示NA-LAAO 可影響ECV304的細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯在G1期，并呈量效關(guān)系；④實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，NA-LAAO 可下調(diào)Cyclin A2、B1、D1、E1，CDK2、CDK6、Survivin、Skp2，上調(diào)p21、p16、p27的表達(dá)，Western-blot 結(jié)果顯示NA-LAAO

6、 可下調(diào)CyclinA、CDK2、CDK6，上調(diào)p21，與定量PCR 一致，可能與其阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。
　　 3.眼鏡蛇L-氨基酸氧化酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及機(jī)制本研究通過(guò)AO/EB 染色、DNA 含量測(cè)定、Annexin V/PI 染色、線粒體膜電位測(cè)定、Caspases和PARP 切割實(shí)驗(yàn)等方法，探討NA-LAAO對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot分析NA-LAAO對(duì)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2家族分子

7、的影響，探討NA-LAAO 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。結(jié)果：①AO/EB 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，低劑量NA-LAAO 可使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡樣特征；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NA-LAAO 可使細(xì)胞的DNA 含量降低，出現(xiàn)亞二倍體DNA 凋亡峰；Annexin V/PI雙染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NA-LAAO 可使細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NA-LAAO 處理8 h 可使ECV304細(xì)胞中的JC-1發(fā)生從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，這些結(jié)果說(shuō)明NA-LAA

8、O 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；②NA-LAAO 處理可使Caspase-9、Caspase-3 活化，并降解Caspase-3 底物PARP-1，提示NA-LAAO 可激活內(nèi)源性凋亡途徑；③高濃度NA-LAAO 導(dǎo)致的細(xì)胞死亡不受Caspases 抑制劑z-VAD-fmk 影響，提示NA-LAAO 可誘導(dǎo)不依賴于Caspases的細(xì)胞死亡；④實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot 結(jié)果顯示，NA-LAAO 可上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Hrk、N