江浙短尾蝮蛇毒解離素的分離純化及體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究.pdf

1、整合素是普遍存在于細(xì)胞中的一種跨膜糖蛋白，廣泛參與體內(nèi)的生理和病理過(guò)程，其拮抗劑在抗血小板聚集、抗腫瘤以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移中展示出良好的應(yīng)用前景，是藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要方向。根據(jù)阻斷受體的作用機(jī)制不同，整合素拮抗劑可分為以下兩類：(1)抗整合素單克隆抗體如GPIIb/Ⅲa受體人一鼠嵌合單克隆抗體阿西單抗(Abciximab，c7E3)，已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床，是目前最成功的抗血小板藥物；(2)能夠封閉整合素結(jié)合位點(diǎn)的拮抗劑包括來(lái)源于天然生物

2、毒素的解離素(Disintegrin)以及以合成多肽和肽類衍生物等。解離素是主要從蛇毒中分離的能夠阻斷整合素與其配體結(jié)合的一類富含半胱氨酸的小分子多肽，含有精-甘-天冬氨酸(Arg-Gluy-Asp，RGD)、賴一甘一天冬氨酸(Lys-Gluy-Asp，KGD)等序列。RGD序列是ECM及其基底膜中的纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、凝血酶敏感蛋白、骨橋蛋白和血管性假血友病因子等所含有的高度保守的氨基酸序列，其與腫瘤細(xì)胞、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴

3、管內(nèi)皮細(xì)胞表面以及血小板等表面的整合素結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)過(guò)程。含有RGD序列的解離素可以競(jìng)爭(zhēng)性地與上述整合素配體結(jié)合，干擾腫瘤細(xì)胞-ECM或與其他細(xì)胞間的相互作用，從而抑制血小板聚集形成瘤栓、腫瘤血管新生，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的目的。本課題擬從江浙短尾蝮蛇蛇毒(Gloydius brevicaudus venom，GBV)中分離純化解離素，測(cè)定理化性質(zhì)和氨基酸序列，觀察其體外抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、 1．解離素的分離純化及部分理化性質(zhì)測(cè)定 應(yīng)用Slaperdex 75凝膠過(guò)濾色譜，從江浙短尾蝮蛇粗毒中分離得到7個(gè)蛋白峰；其中蛋白峰Ⅳ可抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集，初步鑒定為具有解離素活性的組分。該組分再通過(guò)Sephadex G-25凝膠過(guò)濾、DEAE Sepharose FastFlow離子交換色譜和Lichrospher C18反相色譜純化得一個(gè)解離素純品，暫定名為GBVⅣ4。GBVⅣ4在SDS-PA

5、GE(Tris-Tricine系統(tǒng))凝膠電泳中，呈單一蛋白條帶，質(zhì)譜法測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為7442Da，氨基酸序列測(cè)定由70個(gè)氨基酸組成，含有RGD三肽活性中心，符合中鏈解離素特征(約70個(gè)氨基酸，6對(duì)二硫鍵)。通過(guò)Genbank檢索，未發(fā)現(xiàn)與GBVⅣ4序列完全一致的氨基酸序列，且GBVⅣ4與其他已發(fā)現(xiàn)的解離素有很高的同源性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為GBVⅣ4是一種新的解離素蛋白。 2．GBVIV4對(duì)血小板聚集的影響 采

6、用經(jīng)典的Born法，發(fā)現(xiàn)GBVⅣ4在體外可抑制多種聚集劑誘導(dǎo)的血小板聚集，且該作用呈明顯的量效關(guān)系，GBVⅣ4對(duì)ADP、凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的EC<,50>分別為0.298μg/ml和0.577μg/ml。 3．GBVIV4對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞體外粘附的影響 細(xì)胞一基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GBVⅣ4對(duì)B16細(xì)胞粘附能力的影響。相差顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，未加藥組細(xì)胞為梭形、多角形上皮細(xì)胞樣形態(tài)，伸展良好呈“鋪路石”樣排列

7、；加藥組細(xì)胞在給藥后4h細(xì)胞突起回縮變圓，且聚集成團(tuán)簇狀。采用MTT法，發(fā)現(xiàn)GBVⅣ4可抑制腫瘤細(xì)胞與纖維連接蛋白(Fibronection，F(xiàn)n)的粘附作用，抑制作用呈濃度依賴性，在終濃度16μg/ml時(shí)抑制率已達(dá)59.34％。 4．GBVIV4對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞體外遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GBVⅣ4對(duì)B16細(xì)胞遷移能力的影響。在原始致傷區(qū)的基礎(chǔ)上，與未用藥組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在Fn上的遷移均受到明顯抑制。 5

8、．GBVIV4對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞體外侵襲的影響 應(yīng)用Transwell小室重建基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)分析GBVⅣ4對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響，藥物與細(xì)胞作用48h后，細(xì)胞穿越基底膜的能力顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞侵襲數(shù)與藥物濃度成反比。 結(jié)論：從江浙短尾蝮蛇毒中分離得到一個(gè)解離素純品GBVⅣ4，由70個(gè)氨基酸組成，含有RGD三肽活性中心，分子量為7442Da。GBVⅣ4能抑制ADP及凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集：GBVⅣ4在體外具有較強(qiáng)的