舟山眼鏡蛇神經(jīng)毒素的分離純化、活性測定及鎮(zhèn)痛作用研究.pdf

1、目的：從江西產(chǎn)舟山眼鏡蛇粗毒中分離并純化得到電泳純神經(jīng)毒素組分,研究其受體動力學(xué)特性和鎮(zhèn)痛作用。
　　方法：1.采用SP Sepharose Hign Performance陽離子交換色譜和Superdex30凝膠過濾色譜，兩步快速分離法從江西產(chǎn)舟山眼鏡蛇粗毒中提純得到神經(jīng)毒素組分，用離體大鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本鑒定其性質(zhì)，用SDS-PAGE(Tris-Tricine系統(tǒng))電泳鑒定其純度。
　　2.采用Meier法，測定小鼠腹腔

2、注射眼鏡蛇神經(jīng)毒素的LD50近似值，通過離體蛙腹直肌標(biāo)本，以維庫溴銨(vecuronium bromide，Vec)為對照，研究眼鏡蛇神經(jīng)毒素與N2-AChR的相互作用。
　　3.選用3種測痛實(shí)驗(yàn)：電刺激－嘶叫法，熱板法，醋酸扭體法觀察眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛活性。
　　4.采用連續(xù)7日給藥法觀察眼鏡蛇神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛作用的耐受性，采用納洛酮催促戒斷實(shí)驗(yàn)觀察眼鏡蛇神經(jīng)毒素的成癮性。
　　結(jié)果：1.眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)過 SP Sep

3、harose Hign Performance陽離子交換色譜得到21個蛋白峰，其中第IX峰（暫名為NNAV-IX）過Superdex30凝膠過濾色譜所得的第IV峰經(jīng)鑒定為分子量為15kDa左右的神經(jīng)毒素純品，暫命名為NNAV-IX4。
　　2.小鼠腹腔注射NNAV-IX4的LD50近似值為0.501mg/kg。在NNAV-IX4作用下,ACh對蛙腹直肌的累積劑量-效應(yīng)曲線平行右移。計算NNAV-IX4和Vec的拮抗參數(shù)pA2分別為

4、7.33和6.48，NNAV-IX4和Vec的解離常數(shù)KD分別為0.0512μmol/L和0.330μmol/L。
　　3.NNAV-IX4的鎮(zhèn)痛作用存在一定的量效關(guān)系和時效關(guān)系，NNAV-IX4腹腔注射給藥后2h起效，5h達(dá)峰值。與 NS組比較，NNAV-IX4對3種小鼠疼痛模型的痛閾均能顯著提高(P<0.05)。尤其是在小鼠電刺激－嘶叫法實(shí)驗(yàn)中，NNAV-IX4組給藥后5h后可使小鼠痛閾提高了526.32％，而哌替啶組給藥后1

5、h小鼠痛閾只提高171.63%(P<0.05)。
　　4.與每天給藥前相比，NNAV-IX4組小鼠連續(xù)7d給藥后5h的痛閾值持續(xù)提高，并且在第7日痛閾達(dá)最高值(P<0.05)。嗎啡組小鼠僅第1、2d用藥后1h痛閾明顯升高(P<0.05)，隨后5d給藥前后痛閾相比無顯著性差異。與NS組比較，嗎啡組小鼠納洛酮催促戒斷后體重減輕克數(shù)和平均跳躍次數(shù)均有顯著差異(P<0.05)，而NNAV-IX4組無顯著差異。
　　結(jié)論：1.舟山眼鏡