Aurora B靶向性抑制劑的篩選及小分子化合物S2的藥學(xué)價(jià)值探討.pdf

1、有絲分裂過(guò)程中,通過(guò)染色體的分離,母細(xì)胞平均分配自己的遺傳物質(zhì)至子細(xì)胞,使子細(xì)胞得到完全相同的遺傳物質(zhì)。忠實(shí)的染色體分離和胞漿運(yùn)動(dòng)是保證兩個(gè)子細(xì)胞得到完全相同的遺傳物質(zhì)的前提條件,上述過(guò)程的缺陷容易引起非整倍體或多倍體。Aurora是保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族之一,在染色體的分離和胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)中有非常重要的作用。Aurora家族的三個(gè)成員(AuroraA/B/C)在細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控中起到重要的作用。根據(jù)眾多研究成果顯示,針對(duì)Aurora

2、設(shè)計(jì)的小分子抑制劑能夠有效的抑制腫瘤,是藥物研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 首先,我們成功的建立了有效的高通量篩選模型。采用這個(gè)高通量篩選模型,我們對(duì)國(guó)家新藥篩選中心庫(kù)藏的70,000個(gè)小分子化合物進(jìn)行了高通量篩選,得到了近1000個(gè)一級(jí)陽(yáng)性化合物,進(jìn)而從一級(jí)陽(yáng)性化合物中篩選出數(shù)十個(gè)二級(jí)陽(yáng)性化合物。通過(guò)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)組的檢驗(yàn),該模型的各項(xiàng)參數(shù)都達(dá)到了高通量篩選模型構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 通過(guò)Biacore3000檢測(cè),我們驗(yàn)證了陽(yáng)性化合

3、物與Aurora激酶的相互作用并計(jì)算結(jié)合動(dòng)力曲線,證實(shí)陽(yáng)性化合物與目標(biāo)靶點(diǎn)有很強(qiáng)的結(jié)合能力。對(duì)化合物的激酶特異性進(jìn)行檢測(cè),證實(shí)在參與測(cè)試的二十種激酶中,陽(yáng)性化合物對(duì)Aurora激酶的抑制強(qiáng)度全部排在首位,對(duì)其他激酶大多沒(méi)有非特異性抑制。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證陽(yáng)性化合物是否能夠在細(xì)胞水平上對(duì)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)和增殖起到抑制作用,我們針對(duì)化合物的后期驗(yàn)證建立了專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞模型。在國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)的支持下,我們對(duì)陽(yáng)性化合物作用于近二十

4、種細(xì)胞系的IC50進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明,通過(guò)化合物培養(yǎng)基摻入處理96h,包括肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、宮頸癌、胰腺癌等多種組織來(lái)源在內(nèi)的細(xì)胞系顯示出不同程度的生長(zhǎng)抑制。而在去除化合物后,部分細(xì)胞系恢復(fù)正常生長(zhǎng),另一部分細(xì)胞系無(wú)法恢復(fù)正常的快速生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 通過(guò)對(duì)多種細(xì)胞系的時(shí)間梯度和藥物濃度梯度生長(zhǎng)曲線進(jìn)行檢測(cè),我們測(cè)定了化合物的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制IC50曲線。通過(guò)化合物摻入處理,肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、宮頸癌、胰腺癌等

5、多種組織來(lái)源的細(xì)胞系增殖均受到了較大程度的抑制。克隆形成率試驗(yàn)證明,化合物處理的腫瘤細(xì)胞單克隆的形成能力大大下降。通過(guò)westernblotting,immunofluorescence等方法,檢測(cè)到內(nèi)源性HistoneH3(Ser10)的磷酸化水平大幅下降,通過(guò)驗(yàn)證化合物在細(xì)胞水平對(duì)AuroraB激酶活性的抑制,初步探明了化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)理。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,化合物處理的細(xì)胞出現(xiàn)顯著的G2/M期阻斷。
　　 為

6、驗(yàn)證化合物在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,我們建立了化合物體內(nèi)作用檢測(cè)的動(dòng)物模型。對(duì)于人QGY裸鼠移植瘤模型,化合物于5mg/kg的劑量即顯示明顯的抑瘤效果(p＜0.05)。通過(guò)小鼠急性毒理實(shí)驗(yàn)檢測(cè),化合物的半數(shù)致死量為有效劑量近40倍,在小鼠中未見(jiàn)明顯副作用。
　　 長(zhǎng)期以來(lái),傳統(tǒng)抗癌藥物大都是屬于細(xì)胞毒類(lèi)藥物。盡管傳統(tǒng)抗癌藥物具有一定的臨床療效,但由于它們無(wú)法區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常機(jī)體細(xì)胞,因而會(huì)引起嚴(yán)重毒副反應(yīng)。2001年,諾華公

7、司的酪氨酸激酶抑制劑藥物格列衛(wèi)(Gleveec)的上市,標(biāo)志著激酶抑制劑類(lèi)藥物正式獲得認(rèn)可。2006年,多靶點(diǎn)藥物多吉美(Sorafenib)的上市,更顯示出了多靶點(diǎn)靶向性治療藥物的發(fā)展趨勢(shì)。多吉美一方面通過(guò)抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng),另一方面通過(guò)抑制VEGFR和PDGFR阻止為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)的新生血管生成,通過(guò)雙重作用機(jī)理而達(dá)到治療效果。靶向性藥物可以針對(duì)攜帶有特異性靶標(biāo)的癌癥細(xì)胞,同時(shí)具有較少的毒副反應(yīng),因

8、此,靶向抗癌藥物已經(jīng)逐漸開(kāi)始成為腫瘤治療領(lǐng)域里的骨干力量。近幾年來(lái),針對(duì)Aurora.的小分子激酶抑制劑藥物開(kāi)發(fā)得到了國(guó)際科研界和醫(yī)藥工業(yè)界的高度重視,出現(xiàn)了如ZM447439,Hesperadin,VX-680,AZD1152,PHA-680632等進(jìn)入臨床研究階段的小分子抑制劑。因此,我們針對(duì)AuroraB的小分子抑制劑篩選及藥學(xué)研究,以期為具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的小分子新藥研發(fā)提供新的線索。
　　 另外,我們還就人類(lèi)甘油磷酸

9、化二酯酶(Glycerophosphodiesterphosphodiesterase,GDPD)基因的克隆和主要功能進(jìn)行了初步研究。我們從人類(lèi)睪丸cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增GDPD5的全長(zhǎng)序列。根據(jù)生物信息學(xué)分析,該基因在UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中定位在11q13.4-q13.5。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn),我們檢測(cè)了GDPD5在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位情況,并以RT-PCR的方法分析GDPD5基因在人類(lèi)各種組織中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)GDP