靶向蛋白激酶C抑制劑篩選模型的建立及化合物的篩選與評(píng)價(jià).pdf

1、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，由日本學(xué)者Nishizuka于1977年首次發(fā)現(xiàn)，為存在于細(xì)胞漿內(nèi)由鈣激活的磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的重要介質(zhì)，具有多種功能。根據(jù)它們對(duì)Ca2+、DAG的依賴性，將其分為經(jīng)典型PKC、新型PKC、非經(jīng)典型PKC及PKCμ四大類。 早期研究表明PKC能夠被促腫瘤劑佛波酯(TPA)激活，隨后的大量研究進(jìn)一步證實(shí)PKC在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮著重

2、要作用，使得PKC成為腫瘤疾病的重要治療靶點(diǎn)。研究表明，PKCα與腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期調(diào)控及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；PKCβII參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成等多個(gè)環(huán)節(jié)：而PKCδ的激活則引起促進(jìn)腫瘤形成的SHH信號(hào)通路及非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的活化。由此可見(jiàn)，PKC家族中的PKCα、PKcβII和PKCδ三種亞型與腫瘤關(guān)系密切，并且已有一些特異性抑制劑和寡聚核苷酸藥物進(jìn)入臨床研究，如PKCα抑制劑Aprinocarsen，PKcβ抑

3、制劑Enzastaurin等，但是結(jié)果仍不盡人意。因此，建立以PKCα、PKCβII和PKCδ為分子靶點(diǎn)的亞型特異性PKC抑制劑篩選模型，將為開發(fā)抗腫瘤藥物提供活性篩選的技術(shù)平臺(tái)。 基于上述研究背景，本論文旨在利用熒光偏振技術(shù)和構(gòu)建PKC表達(dá)水平不同的細(xì)胞株的方法，分別建立分子水平和細(xì)胞水平PKCα、PKCβII和PKCδ的抑制劑篩選模型，在此基礎(chǔ)上對(duì)化合物進(jìn)行篩選，并初步評(píng)價(jià)活性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞行為學(xué)的影響。該論文的研究將為靶

4、向PKC抗腫瘤藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分：分子水平PKC抑制劑篩選模型的建立 本部分實(shí)驗(yàn)利用熒光偏振技術(shù)構(gòu)建了分子水平的PKC抑制劑篩選模型，采用PKC經(jīng)典抑制劑十字孢堿(staurosporine，SP)驗(yàn)證該篩選模型，并進(jìn)行化合物的篩選。結(jié)果表明：本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了分子水平的PKC抑制劑篩選模型，該模型穩(wěn)定可用，并篩選出對(duì)PKCβII具有抑制作用的化合物MD2-03。 第二部分：細(xì)胞水平PKC抑制劑

5、篩選模型的建立及活性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞行為學(xué)影響的評(píng)價(jià)。 本部分實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE，構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)PKC的Hek293-PKCα、Hek293-PKCβII和Hek293-PKCδ細(xì)胞株，應(yīng)用Western Blot和免疫熒光化學(xué)方法對(duì)所構(gòu)建的細(xì)胞株的PKC表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證；并采用PKC激活劑PMA和抑制劑SP驗(yàn)證該細(xì)胞水平篩選模型的可信性，進(jìn)一步應(yīng)用該模型考察MD2-03在細(xì)胞水平中的作用，并在此基礎(chǔ)上初步評(píng)價(jià)了