pBcl-2小分子抑制劑的篩選及其分子藥理研究.pdf

1、Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞內(nèi)源凋亡通路的主要調(diào)控因子，包括具有促凋亡和抗凋亡功能的兩類蛋白質(zhì)。其中抗凋亡蛋白成員主要包括Bcl-2，Bcl-XL和Mcl-1，它們已經(jīng)被確認(rèn)為抗腫瘤靶標(biāo)，正在進(jìn)行小分子BH3功能模擬研究。BH3功能模擬分子通過占據(jù)抗凋亡蛋白的BH3結(jié)合溝槽，釋放促凋亡蛋白Bax/Bak，或者釋放BH3-only蛋白激活Bax/Bak，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是一類已經(jīng)進(jìn)入臨床實驗階段的高效、高特異性的抗癌藥。
　　近期研究

2、發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Bcl-2蛋白(pBcl-2)也是一個重要的抗腫瘤靶標(biāo)。許多類型的腫瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白被高度磷酸化修飾，并且Bcl-2磷酸化水平與多種BH3功能模擬分子的抗性相關(guān)。例如，在多種白血病細(xì)胞系中，pBcl-2(Ser70)抵抗ABT-737和Obatoclax的殺傷作用。但是，目前還沒有發(fā)現(xiàn)可以直接靶向pBcl-2的小分子抑制劑，尤其是至今沒有關(guān)于pBcl-2的BH3溝槽的結(jié)構(gòu)研究，這也限制了pBcl-2小分子抑制劑的分子

3、設(shè)計。
　　本研究基于廣泛的BH3功能模擬分子的分子藥理機(jī)制、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究結(jié)論，提出如下假設(shè):Bcl-2的磷酸化修飾別構(gòu)調(diào)節(jié)了BH3溝槽的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其或者增強(qiáng)了對促凋亡蛋白的親和力，或者在結(jié)構(gòu)上阻斷了現(xiàn)有BH3功能模擬分子的結(jié)合而引起藥物抗性。因此，本研究設(shè)計了基于細(xì)胞表型的pBcl-2抑制劑的篩選，在本課題組研發(fā)的BH3功能模擬分子S1的衍生物中，篩選可能被pBcl-2的BH3溝槽兼容的小分子，并研究其分子藥理機(jī)制，明確Bc

4、l-2磷酸化修飾對其抗凋亡功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本文首先利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法獲得分別表達(dá)非磷酸化Bcl-2(npBcl-2)模擬蛋白(HA-AAA-Bcl-2; T69A/S70A/S87A)和pBcl-2模擬蛋白(HA-EEE-Bcl-2; T69E/S70E/S87E)的HL-60早幼粒白血病細(xì)胞，對23個S1衍生物進(jìn)行篩選。結(jié)合Bax-/-Bak-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞毒性實驗的交叉篩選，得到了特異性依賴Bcl-2通路、拮抗pB

5、cl-2功能的化合物S1-16。
　　接下來，通過ITC和ELIAS技術(shù)分別檢測了S1-16，S1和ABT-737對EEE-Bcl-2蛋白的親和力，以及與Bid-BH3肽段競爭結(jié)合EEE-Bcl-2 BH3結(jié)合溝槽的能力。結(jié)果表明S1-16能夠競爭Bid-BH3肽段結(jié)合EEE-Bcl-2的BH3溝槽，而ABT-737和S1則不能。此外，通過定點突變技術(shù)進(jìn)一步證實了S1-16對EEE-Bcl-2蛋白的親和力來自于BH3結(jié)合溝槽。

6、r>　　本論文通過免疫共沉淀實驗分別檢測了S1-16，S1，ABT-737對HL-60(EEE-Bcl-2)，OCI-AML3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白相互作用的影響，并用免疫印跡法檢測了Bax/Bak的激活、細(xì)胞色素C釋放、PARP的剪切。這一系列的實驗結(jié)果表明S1-16是通過解離細(xì)胞中pBcl-2/Bax和pBcl-2/Bak二聚體，誘導(dǎo)Bax/Bak依賴的內(nèi)源凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞的?；衔颯1-16是唯一一個能夠在過量表達(dá)EEE-Bc

7、l-2和內(nèi)源Bcl-2高度磷酸化的腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡的BH3功能模擬分子。
　　本研究篩選得到了首個pBcl-2直接抑制劑——S1-16。利用S1-16，首次證實Bcl-2在loop區(qū)的磷酸化導(dǎo)致BH3溝槽的變構(gòu)效應(yīng)，提出了pBcl-2 BH3的溝槽與npBcl-2 BH3溝槽在結(jié)構(gòu)上的差異，為pBcl-2小分子抑制劑的設(shè)計及優(yōu)化提供分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時，S1-16作為更廣譜的BH3功能模擬分子，不僅為腫瘤的治療提供了新的策略，也