自體內(nèi)皮祖細胞移植對內(nèi)毒素致兔急性肺損傷生物學作用的實驗研究.pdf

1、目的：急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥(ALI/ARDS)是各種致病因素導致的急性進行性呼吸衰竭,是臨床常見急重癥.其死亡率在20世紀70年代早期高達70％以上,盡管近年來對其認識及救治技術不斷提高,但總體病死率仍然在40％以上。國內(nèi)外學者對 ARDS的治療進行了大量研究并取得了一些進展,但相關治療策略均只能在一定程度上緩解病情,并不能從根本上改善ARDS的不良預后。炎癥反應介導的肺毛細血管內(nèi)皮細胞與肺泡上皮細胞損傷是ARDS的特征性病理

2、改變,因此對受損肺臟進行結構修復和功能重建才是降低ARDS死亡率的理想治療方式.成體干細胞具有多向或單向分化潛能,取材方便,易于分離擴增,并且不涉及到醫(yī)學倫理學的相關問題,因而在ALI/ARDS治療中具有重要的應用價值。內(nèi)皮祖細胞(EPC)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,并且可參與出生后血管新生、再內(nèi)皮化和內(nèi)皮損傷后的修復。鑒于EPC作為內(nèi)源性修復機制在維持內(nèi)皮細胞層完整性方面發(fā)揮了重要的作用,并且內(nèi)皮受損為ARDS早期的特征性病理改變之一,

3、因此EPC移植有希望成為ALI/ARDS的有效治療手段。本研究旨在了解ARDS動物模型不同發(fā)病階段EPC的動態(tài)變化規(guī)律,觀察EPC自體移植以及EPC培養(yǎng)液“無細胞移植”對ARDS的生物作用并探討其可能的作用機制,為提出 ALI/ARDS治療新方法提供實驗線索。
　　 方法：⑴從兔耳中央動脈抽取外周血(10mL/Kg),以密度梯度法分離出單個核細胞(PMC),并將其接種于培養(yǎng)皿內(nèi)；使用添加了細胞因子和胎牛血清的內(nèi)皮祖細胞專用培養(yǎng)液

4、(EGM-2)進行誘導分化培養(yǎng)。首次換液時間為72小時,其后每48小時換液一次。結果顯示,體外培養(yǎng)24小時后可見到單個核細胞粘附于培養(yǎng)皿底部。粘在第3天時,部分細胞呈現(xiàn)出紡錘形變化,并且細胞分裂增殖明顯。此時更換培養(yǎng)液以除去未貼壁細胞和紅細胞。從第5天起,一部分單核細胞轉化為梭形的貼壁細胞,并且隨著體外培養(yǎng)時間的延長,圓形細胞的數(shù)量逐漸減少,而梭形細胞的數(shù)量逐漸增多.在第7天左右可觀察到成團細胞形成的細胞集落。在第14天左右,細胞形狀變

5、為長梭形,并且多角形細胞有融合趨勢.吞噬功能和粘附功能實驗顯示,體外培養(yǎng)的EPC可同時攝取Dil標記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)并粘附FITC標記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1),熒光顯微鏡下雙陽性細胞的比率接近100％.通過免疫熒光對表面標志物進行檢測顯示,95％以上的細胞同時表達血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)和CD34。依據(jù)上述條件可認定通過密度梯度離心后體外培養(yǎng)擴增的細胞為早期EPC。⑵通過耳緣靜脈將

6、內(nèi)毒素(ET055:B5；500μg/Kg和700μg/Kg)注入新西蘭大白兔體循環(huán)內(nèi),72小時后活殺各組動物并取肺組織進行大體病理觀察.對兩組動物的肺組織切片行HE染色顯示,兩組動物均表現(xiàn)為不同程度的肺組織充血、微血管內(nèi)皮損傷、出血和以中性粒細胞浸潤為主的大量白細胞滲出、聚集；同時兩組動物還出現(xiàn)肺泡間隔增厚、破壞以及部分肺泡萎陷不張等病理改變。上述結果提示兩組劑量內(nèi)毒素均可成功建立ALI模型。與500μg/Kg劑量組相比,700μg/

7、Kg劑量組動物的肺組織損傷程度相對較重,但早期死亡率過高,不利于進行后期分析。因此在后續(xù)實驗中采用內(nèi)毒素500μg/Kg建立ALI動物模型。⑶利用內(nèi)毒素(500μg/Kg)建立兔ALI模型,同時以等量生理鹽水注射設立對照組。分別在12小時、24小時、48小時、72小時和第5天抽取外周血.利用流式細胞儀測定外周血中VEGFR-2和CD34雙陽性細胞(EPC)的比率。體外培養(yǎng)細胞后測定 EPC的增殖、粘附和遷移功能。
　　 結果：①

8、對照組外周血EPC比率基本保持穩(wěn)定；模型組外周血EPC比率在內(nèi)毒素注射后即出現(xiàn)降低,24小時后降至最低點,其后有所上升,但第5天時仍低于對照組。EPC增值、粘附和遷移功能均在內(nèi)毒素注射后出現(xiàn)降低,48小時后降至最低點,其后有所上升,第5天時仍低于對照組；模型組在各時間點與對照組相比均具有顯著差異。②CM-Dil標記的EPC可定植于肺組織內(nèi).正常對照組各項指標在各時間點均無顯著變化,并且與肺損傷對照組和EPC移植組相比均具有顯著差異(P<

9、0.01).EPC移植組肺組織病理切片的病變程度輕于肺損傷對照組,但病理評分無統(tǒng)計學顯著差異.與肺損傷對照組相比,EPC移植組的肺濕干比(W/D)和BALF蛋白含量降低,并且在3d和5d時具有顯著差異(P<0.05)；BALF中性粒細胞計數(shù)降低,并且在24h和3d時具有顯著差異(P<0.05)；肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性降低,并且在3d時具有顯著差異(P<0.05)；IL-1β水平降低,并且在3d和5d時具有顯著差異(P<0.05

10、)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平降低,并且在24h和3d時具有顯著差異(P<0.05)；IL-10水平升高,并且在3d時具有顯著差異(P<0.05)；血清細胞間粘附分子1(ICAM-1)水平較低,并且在24h時具有顯著差異(P<0.05)；P選擇素mRNA水平降低,并且在3d時具有顯著差異(P<0.05)。EPC移植組的肺組織細胞凋亡數(shù)量少于肺損傷對照組,并且在5d時最為明顯。肺損傷對照組和EPC培養(yǎng)液組各項指標與正常對照組相比均具

11、有顯著差異(P<0.01).EPC培養(yǎng)液組肺組織普通病理檢查所示的病變程度稍輕于肺損傷對照組.與肺損傷對照組相比,EPC培養(yǎng)液組肺W/D、BALF總蛋白含量、BALF中性粒細胞數(shù)量和肺組織MPO活性均較低,但各指標均不具有統(tǒng)計學顯著差異(P>0.05)。
　　 結論：⑴密度梯度離心聯(lián)合貼壁選擇法能夠成功從外周血中分離中EPC,并可在體外進行培養(yǎng)擴增。⑵在內(nèi)毒素構建的兔ALI動物模型中,外周血EPC數(shù)量以及增殖、粘附和遷徙功能在

12、ALI早期均出現(xiàn)顯著降低；隨著肺部炎癥的消退,EPC數(shù)量和相關功能有所恢復。⑶來源于外周血的自體EPC于移植后可歸巢到受損肺臟,并且可減輕內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷病變嚴重程度。自體EPC移植可通過降低ICAM-1和P-選擇素表達的方式減少ALI起始階段的PMN肺內(nèi)扣押,進而預防肺損傷。自體EPC移植可將內(nèi)毒素誘導的促炎細胞因子反應部分轉化為抗炎細胞因子反應,同時可還可通過減少肺組織細胞凋亡發(fā)揮治療作用.EPC培養(yǎng)液移植可在一定程度上減輕內(nèi)