外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞自體移植對(duì)兔急性肺損傷的影響.pdf

1、本課題主要目的：
　　 急性肺損傷導(dǎo)致彌漫性的肺血管內(nèi)皮，肺上皮損傷和肺泡毛細(xì)血管通透性增加。最近的研究表明外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)移植治療在維持正常內(nèi)皮細(xì)胞功能和修復(fù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用。本研究的目的是評(píng)估自體外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)油酸和內(nèi)毒素急性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)和可能的潛在作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)第一部份旨在從兔外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，在體外定向培養(yǎng)下使其向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化和擴(kuò)增。同時(shí)，通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞特有細(xì)胞表面

2、標(biāo)志物，以及其特異性的吞噬低密度脂蛋白和特異性結(jié)合荊豆凝集素特點(diǎn)來(lái)鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞。本研究第二和第三部份分別采用油酸和內(nèi)毒素靜注建立油酸兔急性肺損傷和內(nèi)毒素急性肺損傷模型，通過(guò)評(píng)估移植自體血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)急性肺損傷的修復(fù)效應(yīng)來(lái)分析其對(duì)急性肺損傷可能的保護(hù)機(jī)制。本研究第四部份通過(guò)轉(zhuǎn)染hVEGF165基因到內(nèi)皮祖細(xì)胞，探討hVEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)其在體外粘附，遷移及增殖能力的影響，從而為體內(nèi)移植轉(zhuǎn)hVEGF165基因的內(nèi)

3、皮祖細(xì)胞奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本課題主要方法：
　　 1.采用Fi col l 密度梯度離心法成功分離，培養(yǎng)，擴(kuò)增和鑒定兔外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞成年雄性新西蘭大白兔，全身麻醉后經(jīng)耳中央動(dòng)脈采血10ml/ kg，利用Fi col l 密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，在體外定向培養(yǎng)基下進(jìn)行培養(yǎng)，使其向內(nèi)皮祖細(xì)胞方向分化，同時(shí)在體外擴(kuò)增。利用內(nèi)皮祖細(xì)胞特有的細(xì)胞表面標(biāo)志物VEGFR2、CD133和CD34，采用免疫熒光和免疫組

4、化進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定。
　　 通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白和特異性結(jié)合荊豆凝集素特點(diǎn)，采用免疫熒光來(lái)證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 2.采用油酸靜脈注射建立兔急性肺損傷模型，用自體內(nèi)皮祖細(xì)胞移植評(píng)價(jià)其對(duì)急性肺損傷的治療效果成年雄性新西蘭大白兔經(jīng)靜注戊巴比妥鈉麻醉后，80mg/ kg油酸右耳緣靜脈緩注。4小時(shí)后，EPCs 移植組從耳緣靜脈注射CM-Di l 熒光標(biāo)記的EPCs(200ml 生理鹽水含大約106個(gè)細(xì)胞)，對(duì)照組注射

5、等量生理鹽水。各組動(dòng)物分別于油酸處理前、油酸處理后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治霾⒂?jì)算PaO2/ Fi O2比值。各組動(dòng)物分別于油酸處理前、油酸處理后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ELISA 法檢測(cè)血清VEGF 含量。48小時(shí)后處死動(dòng)物，取雙肺組織標(biāo)本進(jìn)行病理檢測(cè)，評(píng)價(jià)肺含水量和肺組織多形核白細(xì)胞浸潤(rùn)情況，計(jì)算肺透明膜和出血面積。
　　 3.采用內(nèi)毒素靜脈注射建立兔急性肺損傷模型，用自體內(nèi)皮祖細(xì)胞移植評(píng)價(jià)其對(duì)急性肺損傷的治療效果及探討可能的機(jī)制新西

6、蘭大白兔經(jīng)耳緣靜脈注射苯巴比妥鈉麻醉后，通過(guò)耳靜脈緩慢（超過(guò)30分鐘）注射內(nèi)毒素500mg/ kg 制備兔急性肺損傷模型。內(nèi)毒素注射4h后，實(shí)驗(yàn)組靜注500ml 生理鹽水含自體內(nèi)皮祖細(xì)胞(約106)，對(duì)照組給予同等量生理鹽水靜脈注射。觀察各組動(dòng)物血?dú)猓谓M織病理改變，檢測(cè)血漿NO、MDA 含量和SOD活性，West ern bl ot 檢測(cè)肺組織I NOS和VEGF表達(dá)情況，ELISA法分析血漿細(xì)胞因子IL-1β， E-sel ect

7、I n, ICAM-1和IL-10在損傷肺組織的表達(dá)水平。
　　 4．采用人hVEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，在體外細(xì)胞水平研究基因修飾對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植粘附，遷移和增殖的影響構(gòu)建人hVEGF165基因真核表達(dá)載體，基因修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞，在體外檢測(cè)hVEGF165基因轉(zhuǎn)染對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附，遷移和增殖能力的影響。
　　 本課題主要結(jié)果：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用了一種簡(jiǎn)單實(shí)用的方法從兔外周血中分離、誘導(dǎo)、并能在體外成功培

8、養(yǎng)、擴(kuò)增出具有典型特征的EPCs。本實(shí)驗(yàn)采用綜合方法成功鑒定了EPCs，首先從形態(tài)學(xué)上，培養(yǎng)7天后細(xì)胞呈典型內(nèi)皮祖細(xì)胞集落；其次, 我們采用免疫細(xì)胞化驗(yàn)證了內(nèi)皮祖細(xì)胞特有的表面標(biāo)記物CD34、VEGFR2和CD133，同時(shí)利用內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)吞ac-LDL的功能及特異性結(jié)合UEA-1的特點(diǎn)，采用細(xì)胞熒光化學(xué)方法證實(shí)從外周血能成功分離和培養(yǎng)出自體EPCs。
　　 2.本研究結(jié)果表明：油酸急性肺損傷早期PaO2/ Fi O2比值均顯著降

9、低，自體EPCs 移植后，PaO2/ Fi O2比值逐漸升高，肺功能有明顯改善。急性肺損傷期間，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞激活，表達(dá)粘附分子和趨化大量PMNs的浸潤(rùn)，肺泡-毛細(xì)胞血管膜破壞，蛋白滲透性增加，透明膜形成和肺出血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自體EPCs 移植后，兔肺含水量明顯降低，肺透明膜面積和出血面積顯著減少，PMN 率計(jì)算顯示肺組織PMN 浸潤(rùn)數(shù)量也明顯減少。本研究也探討了EPCs 移植后兔血清VEGF 含量的變化，與對(duì)照組比較，EPCs組血

10、清VEGF 含量在移植后逐漸升高，驗(yàn)證了EPCs 除了直接的細(xì)胞補(bǔ)丁效應(yīng)外，還能分泌VEGF等細(xì)胞因子，通過(guò)旁分泌的方式刺激損傷周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞自我修復(fù)和再生。本研究利用熒光示蹤技術(shù)追蹤和定位了EPCs在肺血管壁的歸巢和整合，表明EPC 靜脈注射后到損傷的肺血管內(nèi)皮參與修復(fù)和重建。
　　 3.本研究結(jié)果表明內(nèi)毒素急性肺損傷后，PaO2/ Fi O2比值均顯著降低，EPCs 移植輸注后能明顯增加其比值。與生理鹽水對(duì)照組比較，自體EPC

11、s 移植后能明顯降低多形核白細(xì)胞在肺組織的浸潤(rùn)數(shù)量，肺水含量和透明膜形成面積和肺出血面積也顯著減少。
　　 血漿NO和MDA的含量明顯減少，SOD 活性卻顯著增強(qiáng)。在損傷肺組織，自體EPCs 處理后，致炎因子IL-1β， E-sel ect I n和ICAM-1表達(dá)水平明顯降低，而抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平卻明顯增加。
　　 同時(shí)，EPCs 移植治療后，損傷肺組織VEGF的表達(dá)水平明顯增加，而I NOS表達(dá)水平卻降低

12、。
　　 4．hVEGF165基因在體外能成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的EPCs能表達(dá)VEGF蛋白，hVEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后能明顯促進(jìn)其增殖、遷移和粘附能力。
　　 本課題主要結(jié)論如下：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)從兔外周血中成功分離、并在體外定向培養(yǎng)、擴(kuò)增出具有典型特征的內(nèi)皮祖細(xì)胞，與骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞相比較，從自體外周血分離和培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，有取材方便，對(duì)機(jī)體損害小，細(xì)胞來(lái)源不受限制，無(wú)倫理方面的爭(zhēng)論，且細(xì)胞純

13、度高的優(yōu)點(diǎn)。
　　 2.外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞自體移植能有效地保護(hù)油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷，從而為內(nèi)皮祖細(xì)胞自體移植治療急性肺損傷提供新的策略。
　　 3.自體內(nèi)皮祖細(xì)胞移植能部份修復(fù)肺內(nèi)皮功能，有效地減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷，其保護(hù)機(jī)制可能與直接通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的修補(bǔ)作用和間接發(fā)揮旁分泌效應(yīng)及抗氧化和抗炎效應(yīng)，為進(jìn)一步探討內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用提供新的思路。
　　 4．內(nèi)皮祖細(xì)胞能成功轉(zhuǎn)染hVEGF165基因