低免疫原性葡激酶的構(gòu)建及功能分析.pdf

1、天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是溶原性金黃色葡萄球菌合成的一種單鏈蛋白，由136個(gè)氨基酸組成，其中包括45個(gè)帶電氨基酸殘基不含半胱氨酸及二硫鍵，分子量15.5kDa。研究發(fā)現(xiàn)SAK可以選擇性的作用于纖維蛋白原。SAK具有纖維蛋白特異性高，對(duì)血小板富集型血栓作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。與同期上市的溶栓藥物相比具有溶栓效果好，專一性強(qiáng)，副作用小，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。我室研制的重組葡激酶(rSAK)已經(jīng)完成二期臨床實(shí)驗(yàn)，對(duì)急性心梗的治療結(jié)果

2、表明，rSAK的再通率顯著高于r-tPA，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。但是SAK作為一種細(xì)菌源性蛋白，在用藥后兩周產(chǎn)生大量中和性抗體，影響其重復(fù)使用。在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用范圍。 對(duì)SAK分子進(jìn)行修飾，改造其抗原表位，是獲得新型低免疫原性溶栓藥物的重要方法之一。本研究利用Biosun軟件，對(duì)我室的野生型SAK(wild typestaphylokinase，wtSAK)的抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并結(jié)合SAK晶體結(jié)構(gòu)和對(duì)其抗原表位

3、研究的報(bào)道，選擇了多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行了缺失和突變，構(gòu)建了10個(gè)SAK的突變體。結(jié)合SAK突變體活性和表達(dá)情況對(duì)其進(jìn)行了篩選。從中選擇了突變體SAK2進(jìn)行了表達(dá)和純化工藝的研究，進(jìn)一步對(duì)其活性和免疫原性進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)。主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．SAK系列突變體的構(gòu)建，表達(dá)，純化及活性分析 利用重疊延伸PCR方法，構(gòu)建了N端缺失及特定位點(diǎn)突變的系列SAK突變體(SAK1-SAK10)。將編碼突變體基因的DNA片段

4、重組入表達(dá)載體pBV220，轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示，SAK1-SAK10在Ecoli/pBV220受體菌中均以包涵體形式表達(dá)。選擇突變位點(diǎn)較多的SAK1，SAK2，SAK7及SAK8重組入pET17b載體中，轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后以可溶性形式表達(dá)。活性檢測(cè)結(jié)果顯示突變體SAK2的溶栓活性與wtSAK相當(dāng)，而其余突變體的活性與野生型SAK(wtSAK)相比均有所下降。 2．

5、SAK2大規(guī)模制備工藝的研究，多克隆抗體制備及抗原抗體反應(yīng)性比較 將E.coliBL21/pET17b-SAK2菌株進(jìn)行發(fā)酵，大量表達(dá)后，進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析兩步純化，SAK2純度達(dá)95％以上。使用纖維蛋白平板溶圈法檢測(cè)SAK2活性，其活性達(dá)到(3.5±1.4)×10<'-4>AU/mg，與野生型SAK活性(4.1±0.8)×10<'-4>AU/mg相當(dāng)。 經(jīng)過(guò)兩次加強(qiáng)免疫，制備wtSAK和SAK2

6、的兔源多抗，抗血清的滴度達(dá)到1×10<'7>時(shí)取血。用ELISA檢測(cè)抗原抗體的反應(yīng)性；使用纖維蛋白平板溶圈法檢測(cè)兔抗wtSAK抗血清分別與wtSAK和SAK2結(jié)合后的蛋白溶栓活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SAK2與兔抗wtSAK抗體的反應(yīng)性顯著下降，與兔抗wtSAK結(jié)合后的溶栓活性下降程度顯著低于wtSAK，說(shuō)明wtSAK中的部分抗原表位已被缺失。 使用飽和硫酸胺沉淀法粗提兔抗wtSAK和兔抗SAK2，再用DEAE柱陰離子交換純化IgG抗體

7、，得到兔抗wtSAK和兔抗SAK2多克隆抗體。經(jīng)ELISA法檢測(cè)抗體滴度為1×10<'5>。 3．wtSAK和SAK2在獼猴體內(nèi)產(chǎn)生抗體的比較 以獼猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選擇小劑量多次給藥的給藥方案：使用0.02mg/kg體重劑量；隔天給藥；給藥七次持續(xù)兩周。停止給藥后十周再次給藥，給藥方案與第一次相同，給藥結(jié)束后觀察十一周。整個(gè)過(guò)程中選擇15個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，使用ELISA方法檢測(cè)獼猴血清中抗體水平。選擇抗體水平最高的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)

8、血清的中和活性。對(duì)wtSAK組和SAK2組的抗體水平檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明兩組整體的抗體變化趨勢(shì)基本一致，均在第二輪給藥期出現(xiàn)抗體水平的明顯升高，但SAK2組抗體水平顯著低于wtSAK組。wtSAK組在第一輪給藥中出現(xiàn)了抗體水平的小幅升高，而SAK2組抗體水平在第一輪給藥期無(wú)明顯變化。wtSAK和SAK2分別和各自的獼猴抗血清溫育結(jié)合后，wtSAK的溶栓活性僅保持了3.8％，而SAK2的殘余溶栓活性為75.3％。以上結(jié)果說(shuō)明在小劑量反復(fù)給藥方案下

9、SAK2的效果優(yōu)于wtSAK。在給藥期和觀察期共6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)SAK2的活性受其抗體影響較小。 4．小劑量反復(fù)用藥方案對(duì)機(jī)體血纖溶系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的影響 在反復(fù)多次給藥的6個(gè)月觀察期內(nèi)，選擇反映血凝的指標(biāo)PT，APTT，TT，和反映纖維蛋白溶解系統(tǒng)的指標(biāo)FIB，PLG，α<,2>-PI進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示以上各指標(biāo)在用藥過(guò)程中均無(wú)顯著變化。 綜上所述，我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了SAK的系列突變體；篩選并獲得了活性較高，抗原性降低