亞洲璃眼蜱防御素基因克隆、原核表達及功能分析.pdf

1、亞洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum）分布于荒漠和半荒漠地區(qū)，生境主要在胡楊林和灌叢，宿主為牛、羊、馬、野豬和雙峰駝，也侵襲人。亞洲璃眼蜱可傳播新疆出血熱、Q熱、環(huán)形泰勒蟲病等多種自然疫源性疾病。防御素是一種抗菌多肽，在機體先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，研究蜱源防御素對探索蜱與病原體之間的關(guān)系、開發(fā)抗蜱藥物和控制蜱傳疾病具有重要意義。
　　本研究以亞洲璃眼蜱為研究對象，提取總RNA后利用Clontech建庫試劑盒構(gòu)建cD

2、NA文庫，利用PCR技術(shù)進行分子克隆，得到五條防御素基因，分別命名為Ha-defensin-1、Ha-defensin-2、Ha-defensin-3、Ha-defensin-4和Ha-defensin-5。開放閱讀框大小分別為219bp、222bp、222bp、207bp、和222bp，編碼氨基酸個數(shù)為73、74、74、69和74，等電點分別為9.08、9.54、9.89、5.53和9.99。與NCBI發(fā)布的其他蜱源防御素的氨基酸序列

3、相似性范圍為53％～82％。
　　對Ha-defensin-1和Ha-defensin-2進行原核表達并研究重組蛋白的功能。分別將Ha-defensin-1和Ha-defensin-2連入表達載體pET-32(a+)轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)感受態(tài)細胞中表達，并進行表達條件的摸索和優(yōu)化，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白大小約25kDa，與預(yù)測大小一致。利用Real-time PCR技術(shù)對Ha-defensin-1和

4、Ha-defensin-2的表達情況進行初步分析，結(jié)果顯示Ha-defensin-1和Ha-defensin-2基因的表達具有時期、組織和不同菌脅迫時的特異性。通過抑菌圈實驗、最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有抑菌活性，但存在差異性。抗氧化實驗結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-d