簡介：IIIMLLLLILULLLLLULLLIILLIIIY3345734中國醫(yī)科大學博士學位論文GANKYRIN對胃癌細胞生物學行為和化療敏感性的影響及機制研究THEMECHANISMANDTHEEFFECTOFGANKYRINONTHEBIOLOGICALBEHAVIORANDCHEMOSENSITIVITYOFGASTRICCANCERCELLS論文作者萱墊些指導教師主廑整撞申請學位匿鱟擅±培養(yǎng)單位一級學科墮座匡堂二級學科壁疸堂研究方向中國醫(yī)科大學遼寧2017年10月摘要目的GANKYRIN是一個新的癌基因，最早在肝癌組織發(fā)現(xiàn)。GANKYRIN編碼的蛋白含有226個氨基酸，由7個錨蛋白ANKYRIN重復序列組成，在結構上高度保守，分子量約為25KDA。研究表明，肝癌、結腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織QBGANKYRIN蛋白高表達，并且與腫瘤的惡性程度密切相關，顯示GANKYRIN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。盡管GANKYRIN在不少惡性腫瘤中高表達，然而現(xiàn)有的研究大部分集中在GANKYRIN與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預后及耐藥等方面，在胃癌等其它腫瘤的研究還不夠深入，沒有形成體系，缺少GANKYRIN與胃癌、頭頸部腫瘤、肺癌、大腦膠質瘤等惡性腫瘤關系的研究。所以，本實驗擬深入探討GANKYRIN對胃癌細胞生物學行為和化療敏感性的影響及作用機制，對胃癌的預防、診斷、預后判斷及尋找新的藥物靶點都具有重要意義。材料與方法1、采用WESTERNBLOT法和免疫組織化學檢測胃癌和癌旁正常組織GANKYRIN的表達，同時評價GANKYRIN與臨床特征的關系。2、RTPCR和WESTERNBLOT檢測4種胃癌細胞系SGC．7901、MGC．803、BGC．823、HGC．27QBGANKYRIN的蛋白及MRN表達水平。3、使用脂質體法將GANKYRIN的真核表達載體轉染入BGC．823細胞，將GANKYRIN特異SIRNA表達質粒轉染入胃癌HGC．27細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞克隆。4、通過流式細胞術、MTT實驗、軟瓊脂集落形成實驗等方法觀察GANKYRIN在胃癌細胞系增殖中的作用。5、裸鼠皮下成瘤實驗評估GANKYRIN表達改變后，對胃癌細胞的體內成瘤能力及移植瘤生長的影響。6、WESTERNBLOT及RTPCR檢澳LJGANKYRIN上調、下調表達后胃癌細胞中細胞周期相關分子CYCLINDL、CYCLINE、PCNA、RB、P53和P27MRNA及蛋白表達的變化；WESTERNBLOT檢測上述轉染細胞中P13LM～KT通路相關蛋白表達情況P13K、AKT、磷酸化P13K和磷酸化AKT。7、MTT法檢澳LGANKYRIN與胃癌細胞化療藥物敏感性的關系，HOECHST及AV／PI法檢測細胞凋亡，WESTERNBLOT檢測凋亡蛋白CASPASE3和CAPASE9的表達情況。實驗結果1、GANKYRIN在胃癌細胞系和胃癌組織中存在不同程度的表達。GANKYRIN在胃癌組織的陽性表達率100．00％78／78，明顯高于癌旁正常組織【癌旁正常組織的陽性表達率為62．82％49／78，P0．OI。各胃癌細胞系SGC．7901、MGC．803、BGC一823和HGC．27均有表達GANKYRIN，其中HGC．27表達水平最高，III

簡介：目錄?IVABSTRACT?V弓丨言???第一部分文獻綜述?2第1章白細胞介素8IL8的研究進展?311ILB的生理生化特征?312IL8的基因結構、表達和調控?413IL8的受體?414IL8的生物學活性?4141?IL8對中性粒細胞的作用?4142?IL8對淋巴細胞的作用?4143?IL8對堿性粒細胞的作用?4144?IL8在血管發(fā)生中作用?415IL8在腫瘤發(fā)生中的作用?5151?IL8在腫瘤浸潤轉移中的作用及機制?‘?5152?IL8在腫瘤血管生成中的作用?5153?IL8與其它因子在腫瘤進展中的相互作用?616展望和結論?6第2章R干擾素誘導的溶酶體巰基還原酶（GILT的研究進展?721?GILT的活性特征?722?GILT的表達分布?723GIUT與相關疾病?724國內外研究概況、水平和發(fā)展趨勢?7第3章研究物種介簡?931非洲爪蟾簡介???9311非洲爪蟾的分類及形態(tài)特征?9312非洲爪蟾的生活習性及分布?9313非洲爪蟾的研究用途?932非洲爪蟾的研究進展?9321在疾病動物模型中的研究及應用?10322在藥物篩選方面的研究及應用?10I53實驗結果與分析?35531非洲爪蟾GILT基因的克隆與鑒定?36532氨基酸序列的同源比對及系統(tǒng)發(fā)生分析?37533?XLGILTMRNA組織分布研究?38534?XLSGILT蛋白的表達與純化?39535?XLSGILT蛋白的巰基還原酶活性?4054艦?49參考文獻?42附錄碩士在讀期間研究成果?48EILT?49IN

簡介：密級密級博士學位論文NUPR1NUPR1在膠質母細胞瘤中的表達、生物學功在膠質母細胞瘤中的表達、生物學功能及分子機制研究能及分子機制研究作者姓名作者姓名李俊李俊指導教師指導教師徐英輝徐英輝學科專業(yè)學科專業(yè)外科學外科學大連醫(yī)科大學大連醫(yī)科大學碩（博）士學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學位論文是本人在指導教師指導下進行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得大連醫(yī)科大學或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名簽字日期年月日

簡介：華中科技大學碩士學位論文山麥冬的細胞生物學與組織培養(yǎng)研究姓名周健丘申請學位級別碩士專業(yè)生藥學指導教師陳家春20090501華中科技大學碩士學位論文2ABSTRACTLIRIOPESPICATATHUNBLOURISTHEIGINALVARIETYOFLIRIOPESPICATATHUNBLOURVARPROLIFERAYTMAWHICHISKNOWNASTHEMAINMATERIAMEDICAOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEMAIDONGLSPICATAVARPROLIFERAISAAUTHENTICMATERIAMEDICAINHUBEIPROVINCEWITHTHEAIMTOCOPEWITHRESEARCHOFSTERILITYOFLSPICATAVARPROLIFERATHEPRESENTSTUDYWASCARRIEDONLSPICATAINGEICSCYTOLOGYTISSUECULTUREHOPINGTOACQUIRESOMENOVELFINDINGSBETWEENTHETWOPLANTSTHERESULTSARESHOWNASFOLLOWS1KARYOTYPEOFLSPICATAWASEXAMINEDUSINGTHESQUASHMETHODWALLDEGRADATIONHYPOTONICTREATMENTWDHMETHODTHERESULTSINDICATEDTHATSQUASHMETHODWASABETTERWAYFLSPICATA’SKARYOTYPEANALYSISITISTETRAPLOIDTHEKARYOTYPEFMULAWHICHBELONGSTOSYMMETRICAL2BTYPEIS2N4X7248M24SM2MEIOTICBEHAVIPOLLENDEVELOPMENTOFLSPICATAWEREOBSERVEDUSINGTHESQUASHMETHODWDHMETHODPOLLENVIABILITYABERRATIONRATEWEREESTIMATEDDURINGTHEMEIOSISOFMICROSPEMOTHERCELLSMMCMOSTOFTHECELLSDISPLAYEDNMALLYWHILESOMECHROMOSOMEBRIDGESFRAGMENTSLAGGINGONESWEREFMEDATANAPHASE5POLLENABERRATIONRATEWAS344IN1106CELLS3ANTHERPOLLENDEVELOPMENTPROCESSOFLSPICATAWEREOBSERVEDUNDERMICROSCOPEBYMEANSOFPARAFFINSECTIONTHETAPETUMSHOWEDTHEACTERISTICSOFSECRETYTAPETUMWHICHBEGANTODEGRADEDURINGDYADSTAGETHETAPETUMDLELAYERCOMPLETELYDISAPPEAREDWHENPOLLENSWEREFULLYMATUREAT3CELLEDSTAGETAPETUMPLAYEDANIMPTANTROLEINANTHERPOLLENDEVELOPMENT4THISSTUDYSETUPANEWWAYFANTHERCULTUREINTERMEDIATEPROPAGATIONOFLSPICATACALLUSWASINDUCEDFROMANTHEROFLSPICATAONAMSMEDIUMSUPPLEMENTEDWITHDIFFERENTHMONESMSKT20MGL24D10MGLGAVETHEHIGHESTINDUCTIONRATIOWHICHWAS3077MS6BA1520MGLNAA0103MGLWASSUITABLEFTHEINDUCTIONPROLIFERATIONOFINDEFINITEBUDSTHEBUDSWERETRANSFERREDTO12MSMEDIUMSUPPLEMENTEDWITHNAA0103MGLFROOTINGTHESHOOTSPRODUCEDROOTSOFPDFCREATEDWITHPDFFACTYPROTRIALVERSION

簡介：間充質干細胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS是干細胞家族中具有多向分化潛能以及自我更新能力的成體干細胞。自2002年WOODBURY等人首次報道將骨髓MSCS體外誘導分化成神經(jīng)元以來，目前體外誘導MSCS分化成神經(jīng)元細胞有4種方法抗氧化劑誘導、細胞因子誘導、中藥誘導以及基因編輯誘導。如何使MSCS分化而來的類神經(jīng)元細胞具有神經(jīng)細胞的特性，是我們探究的方向。Ω3及Ω6族多不飽和脂肪酸POLYUNSATURATEDFATTYACID，PUFA及其代謝產(chǎn)物與細胞結構及功能有關，它們可以通過多種作用機制，促進干細胞的增殖與分化，繼而影響干細胞的命運。我們的實驗在人臍帶間充質干細胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLS，HUCMSCS神經(jīng)分化培養(yǎng)體系中增補PUFA，包括二十碳五烯酸EICOSAPENTAENOICACID，EPA及二十二碳五烯酸DOCOSAPENTENOICACID，DPA，MTSASSAY以及TRANSWELL遷移實驗結果表明，EPA和DPA可以促進HUCMSCS的增殖、遷移而QRTPCR以及免疫細胞化學檢測表明，增補EPA和DPA后HUCMSCS分化的類神經(jīng)元細胞中多種神經(jīng)元特異性標記的表達高于未增補PUFA的對照組，包括膠質纖維酸性蛋白GLIALFIBRILLARYACIDICPROTEIN，GFAP、神經(jīng)絲蛋白NEUROFILAMENT，NF、酪氨酸羥化酶TYROSINEHYDROXYLASE，TH、神經(jīng)元核抗原NEURONALNUCLEARANTIGEN，NEUN、神經(jīng)元特異性稀醇化酶NEURONSPECIFICENOLASE，NES以及微管結合蛋白2MICROTUBULEASSOCIATEDPROTEIN2，MAP2等。這一結果顯示EPA和DPA參與HUCMSCS增殖、遷移及神經(jīng)分化。本實驗的研究成果有望用于細胞替代治療中，多不飽和脂肪酸增補培養(yǎng)HUCMSCS后，分化成可行使功能的神經(jīng)細胞，替代引起病變的已壞死的神經(jīng)細胞，以達到減緩或治愈神經(jīng)退行性疾病的目的。

簡介：目的通過研究OX40和OX40L分子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE患者外周血淋巴細胞上的表達及其在SLE發(fā)病機制中的可能作用，調控OX40、OX40L在相應靶細胞上的表達和阻斷OX40OX40L通路從而減少炎癥反應的發(fā)生，為治療自身免疫疾病提供新的思路。方法采用流式細胞儀檢測技術對43例SLE患者和15例健康志愿者外周血淋巴細胞上OX40和OX40L的表達水平進行分析，同時，對SLE患者中的腎炎型與非腎炎型外周血淋巴細胞上OX40和OX40L的表達水平進行比較，并對10例SLE患者進行治療前后OX40和OX40L表達水平的比較。測定OX40和OX40L表達水平的具體步驟為1每個流式管加入50UL外周血，分別加入CD4TC、OX40FITC和OX40LPE，4℃度反應時間20MIN；2同時設陰性對照管，對照管中加入CD4TC、IGGFITC和IGGPE或CD19FITC、IGGPE，4度反應20MIN；3加入溶血劑裂解紅細胞直至液體變清；4再加磷酸鹽緩沖液PBS洗滌；5離心1800RPM，5MIN；6離心后，倒掉上清，加05MLPBS上流式細胞儀測表型。結果OX40和OX40L在CD4T細胞上共表達。與正常對照組相比1SLE患者外周血中，CD4TOX40OX40L細胞亞群數(shù)量增加；2CD8TOX40OX40L細胞亞群數(shù)量無變化；3OX40LB細胞增加；4OX40L單核細胞增加；5OX40L在NK細胞上表達增強。在SLE患者中，腎炎型患者CD4OX40T細胞增加且明顯大于非腎炎型；此外，發(fā)現(xiàn)SLE患者治療后OX40和OX40L表達均有不同程度下調。結論SLE患者外周血T淋巴細胞、單核細胞、NK細胞上存在OX40和OX40L的異常表達，在腎炎型患者表達上調，治療前后表達水平有顯著變化。提示OX40OX40L信號在T細胞與單核細胞、NK細胞的相互作用過程中可能有助于T細胞的持續(xù)活化，從而參與SLE的發(fā)生發(fā)展。

簡介：VERO細胞是WHO和我國生物制品規(guī)程認可使用的人用疫苗生產(chǎn)細胞系。VERO細胞廣泛的病毒感染譜、高效的病毒擴殖效率、無致瘤性和便于迅速擴大培養(yǎng)等優(yōu)勢使其成為目前世界人用疫苗生產(chǎn)領域應用最廣泛的細胞株之一。但是，VERO細胞自身高度的貼壁性和對血清的依賴以及在生物反應器中的大量凋亡等缺陷也嚴重制約著現(xiàn)行的疫苗生產(chǎn)工藝。端粒酶逆轉錄酶HUMANTELOMERASEREVERSETRANASE，HTERT被認為是端粒酶的重要組成部分和限速因子。越來越多的證據(jù)顯示，HTERT除參與形成端粒酶復合物、延長端粒長度和保證細胞分裂過程中的基因組穩(wěn)定性之外，可以有效減少惡劣培養(yǎng)環(huán)境帶來的細胞凋亡，提高細胞的生存能力。組成型過量表達HTERT是值得關注和探索的改善細胞培養(yǎng)特性、提高哺乳動物表達系統(tǒng)質量的有效技術途徑。本課題的研究目標是建立能夠穩(wěn)定高水平表達HTERT的VERO細胞系，考察過表達HTERT及不同的HTERT表達水平對VERO細胞體外培養(yǎng)生物學特性帶來的影響。以EGFP為報告基因，借助流式細胞分析驗證了真核表達載體PHEFCHMARHYG在VERO細胞的表達效果，構建了HTERT高效表達載體PHEFCHMARHYGHTERT。采用RTPCR和REALTIMEPCR分析PHEFCHMARHYGHTERT轉染陽性細胞克隆HTERTMRNA的表達水平，從中選取HTERTMRNA相對表達水平是野生型VERO細胞的3526倍和614倍的HTERT組成型過量表達VERO細胞系，T1和T3。采用WESTERNBLOT分析和TRAPPCR的方法驗證了HTERTMRNA、蛋白水平和功能表達的一致性及T1、T3細胞組成型過量表達HTERT的穩(wěn)定性。以活細胞密度和細胞活力為主要觀察指標，結合細胞形態(tài)和貼附伸展動態(tài)，考察HTERT組成型過量表達VERO細胞T1和T3在靜止貼附培養(yǎng)、微載體固定化培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)體系中的細胞生長。HTERT的組成型過量表達在降低VERO細胞的貼附伸展能力的同時，賦予了T1和T3細胞，尤其是T1細胞非貼附依賴性生長的能力。同時，HTERT的組成型過量表達降低了VERO細胞體外培養(yǎng)對血清的依賴程度，提高了細胞批次培養(yǎng)后期的細胞活力和活細胞密度。以葡萄糖比消耗速率QGLU、乳酸比生成速率QLAC、乳酸轉化率YLACGLU和谷氨酰胺比消耗率QGLN為反映細胞代謝的主要觀察指標，考察T1、T3細胞和野生型VERO細胞在靜止貼附培養(yǎng)、微載體固定化培養(yǎng)的細胞代謝。T1、T3細胞在不同的培養(yǎng)體系中均表現(xiàn)為與野生型VERO細胞基本相同的葡萄糖、乳酸和氨基酸代謝特征。表明HTERT的組成型過量表達可能不對VERO細胞的代謝產(chǎn)生明顯的影響。研究結果表明HTERT的組成型過量表達降低了VERO細胞貼附生長依賴性和對血清的依賴程度，有利于在細胞培養(yǎng)后期細胞活力的維持和活細胞密度的提高，是有應用潛力的改良哺乳動物細胞體外培養(yǎng)性狀的技術途徑。

簡介：分類號R737UDC密級重慶醫(yī)科大學碩士學位論文論文題目RONRON在膀胱癌組織中的表達及對在膀胱癌組織中的表達及對T24T24細胞生物學細胞生物學行為行為的影響的影響作者姓名張莎莎張莎莎申請學位級別碩士學科、專業(yè)名稱全科醫(yī)學全科醫(yī)學論文答辯年月2016年5月2016年5月指導教師姓名（職稱、單位名稱）張翾副教授副教授重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院目錄英漢縮略語名詞對照英漢縮略語名詞對照1中文摘要中文摘要3英文摘要英文摘要4RON在膀胱癌組織中的表達及對在膀胱癌組織中的表達及對T24細胞生物學行為細胞生物學行為的影響的影響6前言61材料72方法83結果164討論19全文總結全文總結21文獻綜述文獻綜述22參考文獻參考文獻28致謝37攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文38

簡介：在病毒性疫苗的研究開發(fā)工作中，人二倍體細胞作為病毒抗原的制備基質是整個疫苗研發(fā)及生產(chǎn)質量控制的首要選擇。對作為疫苗制備基質的人二倍體細胞的遺傳穩(wěn)定性及其病毒感染生物學反應特征的相關分析，將為病毒疫苗的研究及開發(fā)包括疫苗安全性的研究提供更為豐富的資料。從細胞生物學的角度看，細胞特定酶學反應特征被認為可以反映細胞的遺傳學特性和生物學性狀?，F(xiàn)有的資料表明，當細胞面臨病毒感染時，其具有天然免疫反應性質的生物學反應事實上是與其自身的生物學性狀相關的。其中細胞所產(chǎn)生的干擾素反應，在病毒疫苗制備技術工藝上又是一個具有重要意義的質量指標，而該指標與細胞增殖過程中的生物學活性狀態(tài)具有直接的相互聯(lián)系。因此，分析細胞酶活性特征與其在病毒感染時的干擾素反應強度，顯然對這類細胞用于疫苗制備時的技術研究具有重要的意義。因此本文采用多種細胞系，多代細胞，通過生化方法檢測細胞內乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力變化以鑒定細胞的穩(wěn)定性。實驗結果表明，人胚肺二倍體細胞（KMB17細胞）和新型的人胚肺二倍體細胞（N0細胞）在細胞代次超過30代后，細胞內的酶活力會發(fā)生一定的變化，乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力上升，超氧化物歧化酶的酶活力下降，表明這兩種細胞在細胞代次超過30代后，細胞的增殖、代謝等能力會下降，細胞穩(wěn)定性較差，不利于用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。VERO細胞和HELA細胞隨著細胞代次增加酶活力無明顯變化，表明這兩種細胞在實驗所采用的細胞代次內，細胞的增殖、代謝等能力基本保持穩(wěn)定。本文重點分析了各種酶活性指標的變化與細胞在RNA病毒和DNA病毒感染時所產(chǎn)生的干擾素反應的相互聯(lián)系，以及這些相互聯(lián)系所導致的病毒感染滴度的變化情況。做為在細胞核內完成增殖和在細胞質內完成增殖的HSV1病毒和EV71病毒感染人胚肺二倍體細胞KMB17、N0時，其引起IFNΑ的相對表達量與細胞的酶活力、細胞的生長狀態(tài)有很大的關系。當人胚肺二倍體細胞培養(yǎng)到第3天時，細胞酶活力處于上升階段，細胞的生長狀態(tài)較好，當細胞培養(yǎng)到第5天時，細胞酶活力處于穩(wěn)定狀態(tài)，細胞的生長狀態(tài)也維持相對穩(wěn)定，兩種病毒感染培養(yǎng)到第5天細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量比感染培養(yǎng)到第3天細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量高，而病毒滴度在感染過程中逐漸上升，但隨著干擾素分泌的增加而其增殖逐漸變低的事實，提示了人二倍體細胞在病毒增殖過程中所具有的容納限度，可能與干擾素的產(chǎn)生濃度相關。當兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天和第5天的HELA細胞時，其引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量與細胞的酶活力關系不大，且比感染其他種類細胞分泌的IFNΑ的相對表達量低，這提示了該細胞作為一種腫瘤細胞的非限制型特征。反之，兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天的VERO細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量比感染培養(yǎng)到第5天細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量高，且病毒滴度前者也高于后者。這一特征有別于人二倍體細胞，似乎提示了VERO細胞的生物學特性，這些通過研究病毒感染后引起細胞分泌的IFNΑ相對表達量的變化與細胞酶活力、細胞生長狀態(tài)之間的關系的工作，雖然這需要進一步的確證和分析，但相關的數(shù)據(jù)將又為疫苗的研究和制備提供相應的實驗依據(jù)。

簡介：目的我們描述并且比較兩種不同方法獲得微血管內皮細胞BRAINMICROVULARENDOTHELIALCELLS，BMECS的方法其目的是為了展現(xiàn)出不同方法獲得微血管內皮細胞的生物學特性，以及探討這兩種方法在細胞生成上是否存在不同。材料和方法一、腦微血管內皮細胞的原代提取和培養(yǎng)一種方法用機械和酶分解的方法處理腦組織，主要涉及密度離心和免疫磁珠純化等步驟，另一種方法包括機械分離，兩次酶消化，20％BSA和PERCOLL離心，加入完全培養(yǎng)基高糖DMEM、20％PDS、4UGML嘌呤霉素（僅應用2天）、100UGML肝素、4NGMLBFGF、10UGML內皮細胞生長支持物、2MML一谷氨酰胺、100UML青霉素、100UGML鏈霉素以及025UGML兩性霉素B。12小時后首次換液以去除未貼壁的細胞及血管段放入37℃，5％CO2孵箱，每隔兩天換液一次。二、蛋白免疫印跡分析用刮刀將BMECS混成，溶于勻漿，溶于PBS以1000R離心5MIN。棄上清后加入裂解液，細胞溶液放置于冰上10MIN，震蕩1MIN后，15000G離心5MIN。收集上清，采用BCA試劑盒測試濃度。上樣后，跑膠，轉膜，脫脂奶粉室溫封閉2小時。TBST洗膜3次10MIN次，一抗孵育過夜，第二天辣根過氧化物酶孵育后上機發(fā)光。三、免疫熒光當BMECS長滿后，去除培養(yǎng)基，溶于1XPBS沖洗3次。預冷100％乙醇被用作兔抗大鼠血管第八因子抗體固定30分鐘，4％多聚甲醛用于固定兔抗大鼠CLAUDIN5固定劑，室溫下固定30MIN。PBS沖洗3次后，01％TRITONX100細胞膜打孔5MIN，PBS清洗后加入5％BSA室溫封閉30MIN。一抗用1％BSA封閉后在4℃下孵育過夜。熒光二抗（FITC異硫氰酸熒光素山羊抗兔IGG，TRITC四乙基若丹明異硫氰酸鹽山羊抗兔IGG）用1％BSA包含DAPI苯基吲哚藍色熒光5ΜGML稀釋并且樣品在37℃避光孵育半小時。四、體外血腦屏障的建立及通透性通過MILLICELLERS（電阻系統(tǒng)）得到的3天的初級電鍍來評估TEER。當BMECS聚集時，1ΜM熒光素鈉的DMEM加入到TRANSWELL系統(tǒng)的上面。計根據(jù)下層小室熒光鈉的吸光度，計算出單層BMECS的通透性。五、細胞內鈣離子測定將細胞放入有含有FLUO3AM10ΜMOLML的DMEM中避光30分鐘，孵育后用ACSF沖洗掉過多的FLUO3AM。BK刺激后細胞內CA2變化采用在共聚焦顯微鏡下在激發(fā)波長為488NM，發(fā)射波長為505NM的數(shù)值下進行測量，F(xiàn)0為細胞靜息狀態(tài)下的熒光變化，△F為變化后的數(shù)值與靜息狀態(tài)下的數(shù)值的比值，整個細胞的鈣離子變化為％△FF0。結果最終的的細胞通過內皮的特殊抗原VONWILLEBRFACT和CLAUDINE5，跨內皮電阻TRANSENDOTHELIALELECTRICALRESISTANCE，TEER，熒光蛋白滲透性和細胞內CA2變化的測量來測定鑒定。最后我們從原代細胞中獲得了兩種生物學特性的細胞并且經(jīng)過鑒定均為微血管內皮細胞，這兩種內皮細胞在形態(tài)學、生態(tài)學特性、跨內皮電阻、應用緩激肽后的反應和內皮細胞的屏障作用均有所差異。結論緩激肽105M觸發(fā)原代腦微血管內皮細胞鈣離子波，細胞外鈣離子是鈣離子峰的前提和必要條件此鈣離子波屬于鈣觸發(fā)鈣離子釋放機制。我們也發(fā)現(xiàn)兩種方法獲得的BEMCS在細胞形態(tài)、TEER、和應用BK后的反應上存在不同，可能是由于細胞的異質性。

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簡介：目的鑒定大鼠骨髓間充質干細胞BMMSC；通過檢測仿生脈沖電磁場BPEMF對BMMSC成骨、成脂肪細胞分化相關基因表達影響，研究其促進成骨及抑制成脂肪分化的效應；在對BMMSC施加電磁場的基礎上加用鈣通道阻滯劑維拉帕米，檢測胞內CAMP水平的變化，探討第二信使對BMMSC的生物學特性的影響，并初步探討其機制。方法選擇體重為80120G的WISTAR大鼠，雌雄不限，應用密度梯度離心貼壁篩選法提取BMMSC，當細胞培養(yǎng)至第三代，用于實驗。實驗分為三組，空白對照組A、BPEMF組B、BPEMF維拉帕米組C。應用MTT測定BPEMF刺激早期39D及后期1115D細胞增殖情況；應用REALTIMEPCR方法測定BMMSC成骨細胞分化關鍵基因核心結合因子RUNX2的表達；應用RTPCR測定BMMSC成脂肪分化基因過氧化物酶增殖因子激活物受體ΓPPARΓ及調節(jié)成骨破骨平衡相關基因骨保護蛋白OPG及核因子KB受體活化因子配基RANKLE的表達；應用ELISA測定BMMSC胞內CAMP、堿性磷酸酶ALP水平的變化。結果提取的細胞呈梭形或多角形，折光性良好。在成骨誘導三周后茜素紅染色可見鈣結節(jié)形成，成脂肪誘導兩周后油紅O染色可見多量脂滴形成，符合BMMSC多向分化的特性；MTT結果顯示BPEMFB組相比空白對照A組對BMMSC在早期有促進增殖的作用，在晚期促進增殖的作用減弱，BPEMF維拉帕米組C組一定程度上抑制細胞增殖；REALTIMEPCR顯示B、C組比A組成骨分化關鍵基因RUNX2表達明顯上調；RTPCR顯示B、C組比A組成脂肪分化相關基因PPARΓ2表達下調，骨保護素基因表達明顯上調，RANKL基因表達影響并不明顯；ELISA顯示ALP、CAMP表達明顯上調。結論BPEMF對BMMSC在刺激早期有促進增殖的作用，這種作用是CA2升高的結果并會隨著刺激的進行而減弱；BEMF會刺激CAMP升高，CAMP起到抑制干細胞增殖并促進成骨分化的作用。BPEMF可以促進成骨分化相關基因表達，抑制促成脂肪分化相關基因表達，從而促進細胞的成骨分化及抑制成脂肪分化；可以促進OPG表達，提高OPGRANKL比值，從而可能通過基因表達對細胞周圍微環(huán)境成骨破骨平衡起到調節(jié)作用。

簡介：目的白血病是起源于造血干祖細胞的一組惡性疾病，在發(fā)病機制以及臨床表現(xiàn)方面具有較大的異質性，近年來，該病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。目前，白血病在診斷及治療方面取得了較大的進展，以化療為基礎的綜合性治療，尤其是異基因造血干細胞移植技術的發(fā)展大大的改善了患者的生存。對白血病發(fā)病機制的深入研究推動了該病的診治進展，慢性粒細胞白血病及急性早幼粒細胞白血病患者受益于靶向藥物的出現(xiàn)，可以長期無病生存。但是除上述兩種類型外，其他類型白血病的治療效果仍不能令人滿意。因此，對白血病發(fā)病機制的深入探討有助于全面了解白血病的發(fā)生及發(fā)展，并為白血病的靶向治療提供潛在的可能。DACT1是DAPPER家族成員之一，可以通過降解WNT通路的關鍵因子散亂蛋白調節(jié)經(jīng)典WNTΒCATENIN信號通路。研究證實DACT1在肝癌、乳腺癌及胃癌等腫瘤細胞中具有抑癌基因的作用，但在結腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。DACT1在髓系白血病細胞中的表達情況及作用尚不明確，其對白血病細胞的增殖及凋亡起到何種作用，作用途徑與其在實體腫瘤中有無異同，都是我們需要探討及解決的問題。為了揭示DACT1在髓系白血病中的作用及機制，我們進行了一系列研究，希望能為白血病的診治提供新的思路。方法采集急性髓系白血病患者骨髓液，通過密度梯度離心法提取單個核細胞，應用實時熒光定量PCR法測定樣本DACT1的MRNA表達情況，并以非惡性血液病患者骨髓標本為正常對照。同時以髓系白血病細胞系K562、HL60、KG1Α、THP1及NB4為研究對象，檢測DACT1MRNA的表達篩選出低表達DACT1的K562及KG1Α細胞應用ATTRACTENETRANSFECTIONREAGENT轉染試劑進行瞬時轉染，通過實時熒光定量PCR和WESTERNBLOT法驗證轉染效果采用免疫熒光法檢測DACT1在細胞中的表達及亞細胞定位利用CCK8法檢測DACT1對K562及KG1Α細胞增殖活性的影響采用克隆形成實驗檢測過表達DACT1對K562及KG1Α細胞克隆形成能力的影響應用ANNEXINⅤFITCPI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率應用流式細胞術檢測過表達DACT1對K562及KG1Α細胞周期分布的影響為了探討過表達DACT1對凋亡相關蛋白的影響，我們應用WESTERNBLOT方法檢測BCL2，BAX，CASPASE3和CASPASE9蛋白的表達情況為了探討DACT1作用于髓系白血病細胞的具體機制，我們應用實時熒光定量PCR法測定WNT通路關鍵因子ΒCATENIN的MRNA表達應用免疫熒光法檢測ΒCATENIN蛋白的亞細胞定位采用WESTERNBLOT法檢測WNT通路靶蛋白的表達。我們進一步利用CCK8法檢測過表達DACT1對白血病細胞化療敏感性的影響應用WESTERNBLOT法檢測過表達DACT1對多藥耐藥蛋白BCRP及PGP的影響為了研究DACT1是否影響藥物外排，應用流式細胞術檢測過表達DACT1對KG1Α細胞中羅丹明濃度的影響。結果⑴DACT1在急性髓系白血病患者中的MRNA表達水平明顯低于非惡性血液病者。應用實時熒光定量PCR方法檢測髓系白血病細胞系K562、HL60、KG1Α、THP1及NB4細胞DACT1MRNA的表達，可見DACT1在髓系白血病細胞中普遍存在低表達。轉染DACT1質?；蚩蛰d質粒VECT進入K562及KG1Α細胞，應用實時熒光定量PCR和WESTERNBLOT法證實了轉染后DACT1在K562及KG1Α細胞中的表達上調。免疫熒光結果顯示DACT1主要表達于細胞漿中，轉染后可以增加DACT1在細胞漿中的表達。應用CCK8法檢測DACT1對K562及KG1Α細胞增殖活性的影響，與K562及K562VECT相比，K562DACT1細胞增殖速度明顯減慢與KG1Α及KG1ΑVECT相比，KG1ΑDACT1細胞增殖速度明顯減慢。DACT1過表達可以抑制K562及KG1Α細胞的增殖活性。克隆形成實驗結果顯示過表達DACT1能明顯抑制細胞的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計學意義轉染48H后應用ANNEXINⅤFITCPI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果顯示過表達DACT1可以誘導K562和KG1Α細胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義采用流式細胞術檢測過表達DACT1對K562及KG1Α細胞周期分布的影響，結果可見G0G1期細胞比例較對照組明顯增高，而S期及G2M期比例降低，，過表達DACT1使K562及KG1Α細胞更多的停滯于G0G1期，差異具有統(tǒng)計學意義。為了檢測過表達DACT1對凋亡相關蛋白的影響，我們應用WESTERNBLOT方法檢測BCL2，BAX，CASPASE3和CASPASE9蛋白的表達情況。結果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，過表達DACT1可以使促凋亡蛋白BAX、CASPASE3、CASPASE9表達升高，抗凋亡蛋白BCL2表達下調。⑵利用實時熒光定量PCR法檢測過表達DACT1后WNTΒCATENIN通路中關鍵因子ΒCATENIN的MRNA表達，結果顯示，DACT1過表達可以使KG1Α細胞中ΒCATENIN的MRNA表達下調采用間接免疫熒光法檢測DACT1過表達是否對ΒCATENIN蛋白的亞細胞定位產(chǎn)生影響，結果顯示，DACT1過表達組細胞核中的熒光強度明顯低于對照組，表明過表達DACT1可能影響了ΒCATENIN在胞漿及胞核中的分布比例，使其在胞核中的量減少利用WESTERNBLOT方法檢測CYCLIND1、CMYC及IL8蛋白的表達，結果顯示，與對照組相比，DACT1過表達組CYCLIND1、CMYC及IL8蛋白的表達明顯下調。⑶利用CCK8法檢測過表達DACT1對柔紅霉素的化療敏感性，柔紅霉素終濃度為1UGML，孵育24H、48H、72H后進行CCK8檢測。結果顯示，過表達DACT1可增加KG1Α細胞對柔紅霉素的細胞毒作用利用WESTERNBLOT法檢測多藥耐藥蛋白的表達，結果顯示，與陰性對照組及空白對照組相比，過表達DACT1組多藥耐藥蛋白BCRP、PGP的表達下調。利用流式細胞術檢測過表達DACT1組、空載體轉染組及空白對照組羅丹明的平均熒光強度，結果顯示，DACT1過表達組KG1Α細胞內羅丹明的平均熒光強度明顯增加，表明過表達DACT1后細胞內藥物濃度明顯增加。結論①同正常對照相比，DACT1在急性髓系白血病患者和白血病細胞系中的表達明顯下調。②過表達DACT1可以抑制白血病細胞的增殖，促進細胞凋亡，使白血病細胞更多的阻滯于G0G1期。③過表達DACT1通過抑制WNTΒCATENIN信號通路影響白血病細胞的生物學行為。④過表達DACT1可以增加KG1A細胞對柔紅霉素的化療敏感性，并使多藥耐藥蛋白PGP及BCRP的表達減少。

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簡介：目的（1）在明確人轉化生長因子Β（HTGFΒ）誘導骨髓間充質干細胞（BMSCS）向骨組織細胞分化作用的基礎上，基于轉基因技術實現(xiàn)BMSCS的HTGFΒ1基因修飾；（2）研究HTGFΒ1聯(lián)合HBMP2協(xié)同誘導BMSCS成骨作用的影響，闡明其成為理想骨組織工程種子細胞價值。方法1利用基因同源重組原理，通過ADMAX腺病毒系統(tǒng)構建HTGFΒ1重組腺病毒，以及對照組病毒PADMAXEGFP3FLAG。2目的基因修飾的骨髓間充質干細胞的建立（1）采用差速貼壁傳代篩選法和流式細胞鑒定相結合，分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞；（2）通過腺病毒載體介導HTGFΒ1基因轉染BMSCS，分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，確定最佳感染復數(shù)；（3）RTPCR檢測轉染后BMSCS中HTGFΒ1的表達情況；ELISA檢測轉染細胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的表達。3雙基因修飾的BMSCS細胞生物學特性分析將外源基因修飾的BMSCS分為5組A正常MSCS組；B空病毒修飾組；CHBMP2修飾組；DHTGFΒ1修飾組；EHTGFΒ1HBMP2修飾組。（1）采用MTT法測定各組細胞增殖能力；（2）酶促反應檢測細胞堿性磷酸酶活性。結果1成功將HTGFΒ1基因導入表達載體PAVMCMVEGFP3FLAG中，構建了重組腺病毒ADHTGFΒ1DNA測序證明，所克隆目的基因序列與GENEBANK收錄一致。（2）通過結合貼壁培養(yǎng)法和流式細胞鑒定高效、快速的分離純化大鼠骨髓間充質干細胞，并通過GFP熒光表達提示目的基因存在于所轉染的細胞中；RTPCR顯示轉染細胞中有大量目的基因MRNA轉錄；ELISA結果顯示轉染細胞胞漿中有目的蛋白的表達。（3）不同基因修飾后的MSCS增殖能力均得到不同程度的增強，其中HTGFΒ1和HBMP2共同修飾對促進MSCS的增殖能力最明顯；ELISA檢測顯示雙轉組中MSCS的ALP活性明顯高于各單轉組。結論（1）利用新的ADMAX腺病毒載體轉染方法可使骨髓間充質干細胞高效穩(wěn)定地表達HTGFΒ1及HBMP2基因；（2）利用兩種基因間的協(xié)同作用，聯(lián)合應用HTGFΒ1和HBMP2可明顯促進組織工程骨種子細胞的成骨化，效果優(yōu)于單用一種生長因子。