hTGF-β1、hBMP-2基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：（1）在明確人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（hTGF-β）誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向骨組織細(xì)胞分化作用的基礎(chǔ)上，基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)BMSCs的hTGF-β1基因修飾；（2）研究hTGF-β1聯(lián)合hBMP-2協(xié)同誘導(dǎo)BMSCs成骨作用的影響，闡明其成為理想骨組織工程種子細(xì)胞價(jià)值。
　　 方法：1.利用基因同源重組原理，通過(guò)AdMax腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建hTGF-β1重組腺病毒，以及對(duì)照組病毒pAdMax-EGFP-3FLAG。

2、　　 2.目的基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立：（1）采用差速貼壁傳代篩選法和流式細(xì)胞鑒定相結(jié)合，分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；（2）通過(guò)腺病毒載體介導(dǎo)hTGF-β1基因轉(zhuǎn)染BMSCs，分別通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，確定最佳感染復(fù)數(shù)；（3）RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs中hTGF-β1的表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的表達(dá)。
　　 3.雙基因修飾的BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性分析：將外源基因修飾的BMS

3、Cs分為5組：A.正常MSCs組；B.空病毒修飾組；C.hBMP-2修飾組；D.hTGF-β1修飾組；E.hTGF-β1+hBMP-2修飾組。
　　 （1）采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖能力；
　　 （2）酶促反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶活性。
　　 結(jié)果：(1)成功將hTGF-β1基因?qū)氡磉_(dá)載體pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中，構(gòu)建了重組腺病毒Ad-hTGF-β1,DNA測(cè)序證明，所克隆目的基因序列與Gene

4、bank收錄一致。
　　 （2）通過(guò)結(jié)合貼壁培養(yǎng)法和流式細(xì)胞鑒定高效、快速的分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)GFP熒光表達(dá)提示目的基因存在于所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有大量目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄；ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿中有目的蛋白的表達(dá)。
　　 （3）不同基因修飾后的MSCs增殖能力均得到不同程度的增強(qiáng)，其中hTGF-β1和 hBMP-2共同修飾對(duì)促進(jìn)MSCs的增殖能力最明顯；ELISA檢測(cè)顯示