DACT1對髓系白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機制的研究.pdf

1、目的：白血病是起源于造血干/祖細(xì)胞的一組惡性疾病，在發(fā)病機制以及臨床表現(xiàn)方面具有較大的異質(zhì)性，近年來，該病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。目前，白血病在診斷及治療方面取得了較大的進(jìn)展，以化療為基礎(chǔ)的綜合性治療，尤其是異基因造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展大大的改善了患者的生存。對白血病發(fā)病機制的深入研究推動了該病的診治進(jìn)展，慢性粒細(xì)胞白血病及急性早幼粒細(xì)胞白血病患者受益于靶向藥物的出現(xiàn)，可以長期無病生存。但是除上述兩種類型外，其他類型白血病的治療效果

2、仍不能令人滿意。因此，對白血病發(fā)病機制的深入探討有助于全面了解白血病的發(fā)生及發(fā)展，并為白血病的靶向治療提供潛在的可能。DACT1是DAPPER家族成員之一，可以通過降解Wnt通路的關(guān)鍵因子散亂蛋白調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路。研究證實DACT1在肝癌、乳腺癌及胃癌等腫瘤細(xì)胞中具有抑癌基因的作用，但在結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。DACT1在髓系白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況及作用尚不明確，其對白血病細(xì)胞的增殖及凋亡起到何種作用，作用途

3、徑與其在實體腫瘤中有無異同，都是我們需要探討及解決的問題。為了揭示DACT1在髓系白血病中的作用及機制，我們進(jìn)行了一系列研究，希望能為白血病的診治提供新的思路。
　　方法：采集急性髓系白血病患者骨髓液，通過密度梯度離心法提取單個核細(xì)胞，應(yīng)用實時熒光定量PCR法測定樣本DACT1的mRNA表達(dá)情況，并以非惡性血液病患者骨髓標(biāo)本為正常對照。同時以髓系白血病細(xì)胞系K562、HL60、KG1α、THP-1及NB4為研究對象，檢測DACT1

4、 mRNA的表達(dá);篩選出低表達(dá)DACT1的K562及KG1α細(xì)胞應(yīng)用Attractene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，通過實時熒光定量PCR和western blot法驗證轉(zhuǎn)染效果;采用免疫熒光法檢測DACT1在細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位;利用CCK-8法檢測DACT1對K562及KG1α細(xì)胞增殖活性的影響;采用克隆形成實驗檢測過表達(dá)DACT1對K562及KG1α細(xì)胞克隆形成能力的影響;應(yīng)用Annexin

5、Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1對K562及KG1α細(xì)胞周期分布的影響;為了探討過表達(dá)DACT1對凋亡相關(guān)蛋白的影響，我們應(yīng)用western blot方法檢測Bcl-2，Bax，Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)情況;為了探討DACT1作用于髓系白血病細(xì)胞的具體機制，我們應(yīng)用實時熒光定量PCR法測定Wnt通路關(guān)鍵因子β-catenin的mRNA表達(dá);應(yīng)用免疫熒光法檢測β-c

6、atenin蛋白的亞細(xì)胞定位;采用western blot法檢測Wnt通路靶蛋白的表達(dá)。我們進(jìn)一步利用CCK-8法檢測過表達(dá)DACT1對白血病細(xì)胞化療敏感性的影響;應(yīng)用western blot法檢測過表達(dá)DACT1對多藥耐藥蛋白BCRP及P-gp的影響;為了研究DACT1是否影響藥物外排，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1對KG1α細(xì)胞中羅丹明濃度的影響。
　　結(jié)果：⑴DACT1在急性髓系白血病患者中的mRNA表達(dá)水平明顯低于非惡

7、性血液病者。應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測髓系白血病細(xì)胞系K562、HL60、KG1α、THP-1及NB4細(xì)胞DACT1mRNA的表達(dá)，可見DACT1在髓系白血病細(xì)胞中普遍存在低表達(dá)。轉(zhuǎn)染DACT1質(zhì)粒或空載質(zhì)粒vector進(jìn)入K562及KG1α細(xì)胞，應(yīng)用實時熒光定量PCR和western blot法證實了轉(zhuǎn)染后DACT1在K562及KG1α細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。免疫熒光結(jié)果顯示DACT1主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，轉(zhuǎn)染后可以增加DACT1在細(xì)胞漿

8、中的表達(dá)。應(yīng)用CCK-8法檢測DACT1對K562及KG1α細(xì)胞增殖活性的影響，與K562及K562/vector相比，K562/DACT1細(xì)胞增殖速度明顯減慢;與KG1α及KG1α/vector相比，KG1α/DACT1細(xì)胞增殖速度明顯減慢。DACT1過表達(dá)可以抑制K562及KG1α細(xì)胞的增殖活性。克隆形成實驗結(jié)果顯示過表達(dá)DACT1能明顯抑制細(xì)胞的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;轉(zhuǎn)染48h后應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染

9、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示過表達(dá)DACT1可以誘導(dǎo)K562和KG1α細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1對K562及KG1α細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果可見G0/G1期細(xì)胞比例較對照組明顯增高，而S期及G2/M期比例降低，，過表達(dá)DACT1使K562及KG1α細(xì)胞更多的停滯于G0/G1期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。為了檢測過表達(dá)DACT1對凋亡相關(guān)蛋白的影響，我們應(yīng)用western blot方法檢測Bcl-2，

10、Bax，Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，過表達(dá)DACT1可以使促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。⑵利用實時熒光定量PCR法檢測過表達(dá)DACT1后Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵因子β-catenin的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，DACT1過表達(dá)可以使KG1α細(xì)胞中β-catenin的mRNA表達(dá)下調(diào);采用間接免疫熒

11、光法檢測DACT1過表達(dá)是否對β-catenin蛋白的亞細(xì)胞定位產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示，DACT1過表達(dá)組細(xì)胞核中的熒光強度明顯低于對照組，表明過表達(dá)DACT1可能影響了β-catenin在胞漿及胞核中的分布比例，使其在胞核中的量減少;利用western blot方法檢測cyclinD1、C-myc及IL-8蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，DACT1過表達(dá)組cyclinD1、C-myc及IL-8蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。⑶利用CCK8法檢測過

12、表達(dá)DACT1對柔紅霉素的化療敏感性，柔紅霉素終濃度為1ug/ml，孵育24h、48h、72h后進(jìn)行CCK8檢測。結(jié)果顯示，過表達(dá)DACT1可增加KG1α細(xì)胞對柔紅霉素的細(xì)胞毒作用;利用western blot法檢測多藥耐藥蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與陰性對照組及空白對照組相比，過表達(dá)DACT1組多藥耐藥蛋白BCRP、P-gp的表達(dá)下調(diào)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1組、空載體轉(zhuǎn)染組及空白對照組羅丹明的平均熒光強度，結(jié)果顯示，DACT1

13、過表達(dá)組KG1α細(xì)胞內(nèi)羅丹明的平均熒光強度明顯增加，表明過表達(dá)DACT1后細(xì)胞內(nèi)藥物濃度明顯增加。
　　結(jié)論：①同正常對照相比，DACT1在急性髓系白血病患者和白血病細(xì)胞系中的表達(dá)明顯下調(diào)。②過表達(dá)DACT1可以抑制白血病細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使白血病細(xì)胞更多的阻滯于G0/G1期。③過表達(dá)DACT1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路影響白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為。④過表達(dá)DACT1可以增加KG1 a細(xì)胞對柔紅霉素的化療敏感