熱休克處理在嗜酸乳桿菌抗凍干脅迫中的應(yīng)用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La.）具有多種益生特性和良好的發(fā)酵性能，被廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)，是乳酸菌發(fā)酵劑的重要菌種之一。真空冷凍干燥是工業(yè)生產(chǎn)中制備直投式乳酸菌發(fā)酵劑的常用方法，但是在冷凍干燥過程中，乳酸菌會(huì)受到多種損傷，導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵制劑活力降低。因此，提高凍干嗜酸乳桿菌的存活率對(duì)制備高活性乳酸菌發(fā)酵劑、提高生產(chǎn)效益都具有重要意義。本文以嗜酸乳桿菌ATCC4356為研究對(duì)象，在冷凍干燥前進(jìn)行

2、熱休克處理，優(yōu)化了熱休克條件、超聲提取菌體全蛋白條件，并利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)比較熱休克處理組與未處理的對(duì)照組在冷凍干燥前后的嗜酸乳桿菌蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜，經(jīng)質(zhì)譜鑒定差異蛋白，利用生物信息學(xué)對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類和代謝途徑分析，從蛋白組學(xué)水平探討熱休克處理調(diào)控嗜酸乳桿菌的抗凍干脅迫機(jī)制。進(jìn)一步通過熱休克

3、預(yù)處理結(jié)合凍干保護(hù)劑來提高嗜酸乳桿菌菌粉凍干存活率，獲得熱休克處理?xiàng)l件和保護(hù)劑的最佳組合為制備高活性乳酸菌發(fā)酵劑提供一個(gè)新思路。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴菌培養(yǎng)時(shí)期、熱休克處理溫度和時(shí)間是影響熱休克處理效果的重要因素。獲得嗜酸乳桿菌ATCC4356的凍干存活率最高的熱休克處理?xiàng)l件，即菌培養(yǎng)18h后，在45℃熱休克處理30min，再進(jìn)行冷凍干燥，其凍干存活率較高，為47％，約為未經(jīng)熱休克處理的對(duì)照組的2倍。⑵對(duì)超聲波法提取細(xì)菌全蛋

4、白的功率和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，得到提取蛋白量最高的超聲條件為：工作6s停6s，150w，5min。制備 P1(凍干前對(duì)照組）、P2（凍干前熱休克組）、P3（凍干后對(duì)照組）和 P4（凍干后熱休克組）四組不同條件下的嗜酸乳桿菌全蛋白樣品，采用基于 iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究構(gòu)建蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜，共鑒定出蛋白質(zhì)1185種，比較不同組間樣品蛋白質(zhì)，統(tǒng)計(jì)得到差異蛋白數(shù)量表明經(jīng)過熱休克處理后菌體的蛋白損失明顯減小，說明熱休克處理對(duì)菌體蛋白有保護(hù)作

5、用。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明熱休克處理主要通過調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞中脂類代謝、糖代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)錄和翻譯、應(yīng)激蛋白、核糖體的結(jié)構(gòu)及其生物合成相關(guān)的蛋白來提高嗜酸乳桿菌ATCC4356的抗凍干脅迫能力。⑶比較了12種不同的保護(hù)劑與熱休克處理結(jié)合對(duì)嗜酸乳桿菌的凍干保護(hù)效果，其中10種保護(hù)劑能進(jìn)一步增加凍干菌體的存活率，以脫脂乳為凍干保護(hù)劑的菌體存活率最高，以葡萄糖為保護(hù)劑時(shí)，兩種凍干保護(hù)處理的正向疊加作用最明顯，菌的存活率從34.42%