人類PIF1解螺旋酶的功能研究.pdf

1、目的:PIF1基因被普遍認為是輻射敏感型的基因,通過研究PIF1基因參與電離輻射誘導的DNA損傷修復,來探討PIF1基因參與DNA損傷修復的分子機制。利用RNA干擾技術“敲低”PIF1全長基因,進一步的研究PIF1解螺旋酶的生理功能。構建三種重組質粒,用脂質體轉染法將其分別轉染到HeLa細胞中來篩壓穩(wěn)轉過表達的細胞系,用于對PIF1基因的更深入的研究。
　　方法:對培養(yǎng)的HeLa細胞進行不同劑量的γ射線照射,用Western bl

2、ot和Real-Time PCR來檢測PIF1基因的表達量的變化,從變化中來了解和研究PIF1基因在DNA損傷修復中可能存在的功能。利用RNA干擾技術“沉默”PIF1全長基因,通過Western blot和Real-Time PCR來檢測敲低細胞PIF1基因的敲低效果。觀察敲低的細胞系與野生型細胞系在生長狀態(tài)上的差異.對敲低的細胞系進行不同劑量的γ射線照射,通過活細胞計數(shù)了解細胞的增殖能力,流式細胞儀測細胞周期,克隆形成率等實驗來觀察敲

3、低細胞株與野生型細胞株在γ射線照射前后細胞的生存能力、DNA損傷修復情況及細胞周期變化情況。從pCR2.1-TOPO-PIF1原始質粒中,利用PCR方法擴增目的基因PIF1、PIF1N及PIF1C,將目的基因和目的載體pcDNA3.1(-)分別酶切定向連接,構建出三種重組質?！綪cDNA3.1(-)-PIF1、PcDNA3.1(-)-PIF1N、PcDNA3.1(-)-PIF1C】。通過脂質體轉染法將這三種重組質粒分別轉染到HeLa細胞

4、中,篩壓穩(wěn)轉過表達的細胞系。
　　結果:1.HeLa細胞經不同劑量的γ射線處理后通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PIF1蛋白表達量在不同時間點有先降低后升高的趨勢,用Real-Time PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn)PIF1基因在mRNA水平上也出現(xiàn)不同時間點有先降低后升高的趨勢。
　　2.通過Western blot和Real-Time PCR的方法檢測出敲低的細胞系與對照細胞相比較在轉錄與翻譯水平上都有不同程度的敲低現(xiàn)象。對敲

5、低的細胞系進行不同劑量的γ射線照射處理后,活細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)Sh-PIF1-Hela敲低細胞比Sh-NC-Hela對照細胞的生長速度要慢很多且細胞凋亡增加?？寺⌒纬陕蕦嶒灠l(fā)現(xiàn)隨著細胞照射劑量的增加,細胞的增殖能力降低,形成克隆數(shù)減少,敲低細胞與對照細胞相比,細胞的生存能力降低。流式細胞儀測細胞周期發(fā)現(xiàn)敲低細胞G2/M期阻滯明顯延長。
　　3.成功構建出三種重組質粒,并對其轉染的三種過表達的細胞系,通過Western blot法并沒有檢

6、測出PIF1蛋白表達量的升高,但用Real-Time PCR的方法測出PcDNA3.1-PIF1全長和PcDNA3.1-PIF1C端的mRNA相對表達量都有一定程度的增加,而PcDNA3.1-PIF1N端的mRNA的相對表達量并沒有增加。是否構建出穩(wěn)轉的細胞系有賴于進一步的實驗驗證。
　　結論:1.PIF1基因具有輻射敏感性,與DNA損傷修復相關。
　　2.成功的構建出穩(wěn)轉敲低的細胞系(Sh-PIF1-Hela)。發(fā)現(xiàn)PIF